塞來(lái)昔布對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)生長(zhǎng)及 p-ERK2 表達(dá)的影響

王 勃，姜玉峰，李芳芳，王 卓，邢國(guó)強(qiáng)，雷 穎，史紅娟 ，張示杰，彭心宇，呂海龍

塞來(lái)昔布對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)生長(zhǎng)及 p-ERK2 表達(dá)的影響

王 勃1，姜玉峰2，李芳芳1，王 卓1，邢國(guó)強(qiáng)1，雷 穎2，史紅娟2，張示杰1，彭心宇1，呂海龍1

目的 探索塞來(lái)昔布對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)體外生長(zhǎng)及p-ERK2表達(dá)的影響。方法 實(shí)驗(yàn)分組為1640培養(yǎng)基組、DMSO組、塞來(lái)昔布溶液(50、100、150、200 μmol/L)中體外孵育，在倒置焦鏡下觀察原頭節(jié)的形態(tài)變化，同時(shí)通過(guò)0.1%伊紅染色顯示原頭節(jié)活力。運(yùn)用Western blot檢測(cè)DMSO、100、150、200 μmol/L塞來(lái)昔布處理細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)48 h后p-ERK2蛋白的表達(dá)量。結(jié)果 體外孵育7 d后，DMSO組及空白1640對(duì)照組原頭節(jié)的活力幾乎沒(méi)有改變。塞來(lái)昔布作用1 d后，100、150、200 μmol/L組原頭節(jié)的活力均下降；作用3 d后，200 μmol/L組原頭節(jié)全部被殺死，150 μmol/L組的原頭節(jié)活力為43.9%。100 μmol/L、50 μmol/L組對(duì)原頭節(jié)的活力也有明顯下降，但不及高濃度組顯著。Western blot結(jié)果顯示P-ERK2的表達(dá)量隨濃度增加而下降趨勢(shì)明顯。結(jié)論 塞來(lái)昔布能夠抑制細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)生長(zhǎng)，這可能與塞來(lái)昔布下調(diào)P-ERK2的表達(dá)進(jìn)而抑制ERK2信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)。

塞來(lái)昔布；細(xì)粒棘球蚴；原頭節(jié)；ERK2通路

細(xì)粒棘球蚴病是一種危害嚴(yán)重的人獸共患病，在我國(guó)主要分布在畜牧地區(qū)[1]。目前對(duì)包蟲(chóng)病的治療,手術(shù)仍然是主要的手段[2]，但術(shù)中易造成包蟲(chóng)囊腫囊液外溢，以及未殺死的原頭節(jié)殘留于手術(shù)創(chuàng)面或腹腔，這是導(dǎo)致手術(shù)后復(fù)發(fā)最主要的原因[3-4]，如果能尋找一種能在短時(shí)間內(nèi)殺死頭節(jié)又對(duì)周?chē)＝M織損傷小的藥物用于術(shù)后局部使用，有可能對(duì)預(yù)防復(fù)發(fā)起到有效的作用。

本研究以自然感染的綿羊肝細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)為研究對(duì)象，觀察塞來(lái)昔布對(duì)綿羊細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)生長(zhǎng)的影響，進(jìn)一步評(píng)價(jià)塞來(lái)昔布用于臨床抗包蟲(chóng)治療的可能性，為塞來(lái)昔布在肝包蟲(chóng)病治療的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材 料

自然感染細(xì)粒棘球蚴病的綿羊肝臟，由新疆石河子市西部牧業(yè)有限公司提供，塞來(lái)昔布(西樂(lè)葆)購(gòu)自美國(guó)輝瑞制藥有限公司，二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自上海哈靈生物科技有限公司，小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物有限公司，山羊抗小鼠p-ERK2抗體購(gòu)自Santa Cruze公司，小鼠抗β-actin單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruze公司。塞來(lái)昔布膠囊內(nèi)容物用DMSO充分溶解，0.22 μmol/L濾器過(guò)濾備用(DMSO最終濃度<0.1%)。

2 方 法

2.1 細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的分離及體外培養(yǎng) 將新鮮的自然感染細(xì)粒棘球蚴的綿羊肝臟帶回實(shí)驗(yàn)室，生理鹽水沖洗肝臟表面，洗干凈后移入無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精消毒表面，用無(wú)菌方式抽取囊內(nèi)容物置培養(yǎng)瓶中，靜置數(shù)分鐘使育嚢和原頭蚴沉淀后棄去上清液，用PBS液反復(fù)沖洗去掉死亡的原頭蚴，保證原頭節(jié)活力大于98%(0.1%伊紅染色)，然后體外培養(yǎng)原頭節(jié)3 d，待適應(yīng)體外環(huán)境后藥物作用。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 本實(shí)驗(yàn)共計(jì)6組：培養(yǎng)基對(duì)照組、DMSO組及50、100、150、200 μmol/L的塞來(lái)昔布作用組。將體外培養(yǎng)的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)再次用PBS洗滌數(shù)次，使原頭節(jié)活力接近100%，用RPMI 1640培養(yǎng)基混勻原頭節(jié)。每組培養(yǎng)液中加入約2 000個(gè)原頭節(jié)，置37 ℃、10%O2、5%CO2條件下培養(yǎng)，每隔24 h取作用后的頭節(jié)80～100個(gè)，測(cè)活力并計(jì)數(shù)。隔3 d換培養(yǎng)液及復(fù)加藥1次，連續(xù)觀察7 d。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2.3 Western blot檢測(cè)蛋白定量表達(dá) 取100、150、200 μmol/L 塞來(lái)昔布作用48 h組，DMSO組的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)為對(duì)照，用pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌3遍，棄掉上清液，在電子天平中各組稱取質(zhì)量為10 mg的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)，加入150 μL RIPA裂解液，用超聲粉碎儀迅速使原頭節(jié)粉碎，置于冰上裂解15 min。然后移入高壓過(guò)且在冰上預(yù)冷的1.5mL EP管中，置4 ℃離心機(jī)中離心，12 000 g，25 min，離心畢，小心抽取各管中的上清液置新的EP管中。提取總蛋白,測(cè)定蛋白含量并配平為統(tǒng)一濃度, 每個(gè)泳道蛋白的溶液體積5 μL,上樣于SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜, 5%BSA(內(nèi)參用5%牛奶)均用TBST配制, 在常溫下封閉2 h。 一抗(β-actin，P-ERK2)效價(jià)均為1∶1 000，4 ℃孵育18 h, TBST洗膜6次×5 min,隨后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(羊抗小鼠效價(jià)為1∶25 000)室溫下脫色搖床上搖動(dòng)孵育2 h，漂洗同上。 暗室內(nèi)加入化學(xué)發(fā)光劑顯影，用膠片曝光并采圖, 用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)，均以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 光鏡下觀察塞來(lái)昔布作用后的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)形態(tài)變化 倒置顯微鏡下觀察，塞來(lái)昔布作用24 h后，各實(shí)驗(yàn)組均可見(jiàn)蟲(chóng)體不同程度的回縮，隨藥物濃度的增加外翻的原頭節(jié)比例明顯增加，體積變小。作用3 d后，各藥物作用組原頭節(jié)蟲(chóng)體邊緣出現(xiàn)不同程度的損傷，邊緣不規(guī)整，頂突外翻、小勾排列不齊、部分?jǐn)嗔衙撀?，蟲(chóng)體內(nèi)鈣顆粒數(shù)量減少、體積減小，頂突下方吸盤(pán)清晰可見(jiàn)，形態(tài)不規(guī)則?？梢?jiàn)大部分頭節(jié)因結(jié)構(gòu)破壞被染成紅色?？瞻讓?duì)照組原頭節(jié)頂突內(nèi)陷,伊紅染色拒染,可見(jiàn)原頭節(jié)活動(dòng)。

3.2 塞來(lái)昔布對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)生長(zhǎng)的影響 不同濃度塞來(lái)昔布作用后的細(xì)粒棘球原頭節(jié)活力曲線見(jiàn)圖2。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，各濃度塞來(lái)昔布作用組的原頭節(jié)活力值與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DMSO組7 d后活力為(95.5±0.5)%，培養(yǎng)基對(duì)照組作用7 d后活力為(96.5±0.3)%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。200 μmol/L 塞來(lái)昔布作用原頭節(jié)24 h后，活力僅為(3.1%±0.7%)。

Av Control protoscoleces B: Protoscoleces were incubated with DMSO; C: Altered protoscoleces after 1days p. i. with 100 μmol /L celecoxib;D: Altered protoscoleces after 3 days p. i. with 100 μmol /L celecoxib; E: Altered protoscoleces after 1days p. i. with 150 μmol /L celecoxib;F: Altered protoscoleces after 3 days p. i. with 150 μmol /L celecoxib; G: Altered protoscoleces after 1days p. i. with 200 μmol /L celecoxib;H: Altered protoscoleces after 3 days p. i. with 200 μmol /L celecoxib

圖1 光鏡細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)的(100×)(0.1%伊紅染色)

Fig.1 Light microscopy of E. granulosus protoscoleces(100 ×)

從活力曲線圖(圖2)看出，隨著藥物濃度的增加和用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，塞來(lái)昔布對(duì)原頭節(jié)的抑制率增加，即藥物對(duì)原頭節(jié)的抑制作用具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性。

圖2 不同濃度塞來(lái)昔布作用后細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)活力曲線

Fig.2 Survival ofE.granulosusprotoscoleces afterinvitroexposure to celecoxib

3.3 塞來(lái)昔布對(duì)p-ERK2蛋白表達(dá)的影響 Western blot法檢測(cè)DMSO及100、150、200 μmol/L塞來(lái)昔布作用原頭節(jié)48 h后 P-ERK2蛋白表達(dá)(圖3),以ERK磷酸化程度作為評(píng)估塞來(lái)昔布對(duì)原頭節(jié)體內(nèi)該信號(hào)通路活性影響的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得各組p-ERK2及內(nèi)參β-actin蛋白的灰度值,以P-ERK2/β-actin灰度比值進(jìn)行P-ERK2蛋白表達(dá)水平的相對(duì)半定量分析，顯示不同濃度塞來(lái)昔布(100、150、200 μmol/L)處理細(xì)胞48 h后, p-ERK2蛋白表達(dá)量均下降，并呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 不同濃度塞來(lái)昔布作用細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)48 h后磷酸化ERK2蛋白的表達(dá)

Fig.3 p-ERK2 protein expression inEchinococcusgranulosusprotoscolices following treatment with celecoxib at different doses for 48h

4 討 論

新疆是肝細(xì)粒棘球蚴病的高發(fā)地區(qū)[5]，目前該病已被列入國(guó)家轉(zhuǎn)移支付項(xiàng)目區(qū)免費(fèi)救治疾病。目前手術(shù)治療是該病的重要治療方式，但術(shù)中頭節(jié)的外溢難免導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)，因此術(shù)中運(yùn)用有效的局部化療藥物輔助治療是防止復(fù)發(fā)的關(guān)鍵措施。目前臨床肝包蟲(chóng)術(shù)中和術(shù)后常用的輔助化學(xué)藥物有20%的食鹽水，10%過(guò)氧化氫，1.5%西曲溴銨，0.15%氯己定，阿苯達(dá)唑，10%聚維酮碘及95%乙醇等。它們雖然都可以起到殺死原頭節(jié)的作用，但都存在著很多缺點(diǎn)[5]，因此積極尋找術(shù)中抗棘球蚴的新藥成為肝包蟲(chóng)術(shù)后防止復(fù)發(fā)研究中的一項(xiàng)重要課題。

塞來(lái)昔布(celecoxib)是高選擇性COX-2抑制劑[7]，目前被用于各領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)及臨床的研究中，可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)凋亡[8]。以往人們對(duì)塞來(lái)昔布作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)僅限于其能夠抑制COX-2的活性，而起到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，但隨著人們對(duì)其機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入，發(fā)現(xiàn)塞來(lái)昔布等非甾體類(lèi)藥可以在完全缺乏COX活性的細(xì)胞中發(fā)揮抑制生長(zhǎng)的作用，說(shuō)明這類(lèi)藥物除抑制環(huán)氧合酶的途徑外，同時(shí)又有其他途徑的參與而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用[9-11]。張 勇[12]等研究證實(shí)塞來(lái)昔布可通過(guò)抑制ERK2信號(hào)傳導(dǎo)通路而起到抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

本研究觀察塞來(lái)昔布對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)生長(zhǎng)的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，50、100、150、200 μmol/L的塞來(lái)昔布作用原頭節(jié)后其生長(zhǎng)均受到抑制。倒置顯微鏡下觀察各濃度塞來(lái)昔布作用后的原頭節(jié)活動(dòng)度較DMSO和培養(yǎng)基組對(duì)比呈明顯下降趨勢(shì)，說(shuō)明不同濃度的塞來(lái)昔布均對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)均有抑制生長(zhǎng)和殺傷作用，并呈明顯濃度和時(shí)間依賴。

ERK2(細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2)是MAPK信號(hào)通路中一條促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及抗凋亡的通路，本課題組[13]研究發(fā)現(xiàn)ERK抑制劑PD98059體外有抑制原頭節(jié)生長(zhǎng)的作用。本研究結(jié)果顯示塞來(lái)昔布能使細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)磷酸化ERK2表達(dá)減少，并有較明顯的濃度依賴性，表明塞來(lái)昔布能阻斷ERK2磷酸化，從而達(dá)到抑制細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)生長(zhǎng)的作用，間接地表明塞來(lái)昔布抑制細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)生長(zhǎng)作用與ERK2途徑有關(guān)，但是否同時(shí)有其他作用機(jī)制共同參與，值得進(jìn)一步研究。

塞來(lái)昔布于2000年被美國(guó)食品藥品管理局首次批準(zhǔn)用于家族性息肉病的治療，國(guó)內(nèi)已有塞來(lái)昔布用于預(yù)防腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道[15]。本研究只是塞來(lái)昔布對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)生長(zhǎng)一個(gè)初步的探索，但塞來(lái)昔布抗細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的作用機(jī)理還不明確，我們將在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步深入研究，為臨床開(kāi)辟預(yù)防肝包蟲(chóng)術(shù)后復(fù)發(fā)提供新途徑。

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Lü Hai-long，Email：lvhl1999@126.com

Effects of celecoxib on viability and the expression of ERK2 inEchinococcusgranulosusprotoscoleces

WANG Bo1,JIANG Yu-feng2,LI Fang-fang1,WANG Zhuo1,XING Guo-qiang1, LEI Ying2,SHI Hong-juan2, ZHANG Shi-jie1,PENG Xin-yu2,LYU Hai-long1

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheFirstAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,ShiheziUniversity,Shihezi832008，China; 2.DepartmentofHistologyandEmbryology,SchoolofMedicine,ShiheziUniversity,Shihezi832008，China)

The aim of this study was to explore the celecoxib in the viability ofEchinococcusgranulosusprotoscoleces, and to investigate the expression of extracellular signal-regulated kinase 2 (ERK2). Protoscoleces ofE.granulosuswere incubatedinvitrowith celecoxib at concentrations of DMSO, 50, 100, 150, 200 μmol/L，and the viability of protoscoleces was assessed on a daily basis by microscopic observation of movements, flame cell activity, and 0.1% eosin staining. P-ERK2 expression was determined by Western blot to evaluate the activation of ERK2. Control protoscolices incubated in the DMSO and RPMI 1640 medium were not altered and remained viable (95.5±0.5)% after 7 days of incubation. From day 1,the viability of protoscoleces started to decline due to the 150, 200 μmol/L of celecoxib. After 2 days,viable protoscoleces were no longer observed in cultures treated with 200 μmol/L of celecoxib but survival of (3.1±0.7)%.At 150μmol/L, celecoxib had a clearly decreased efficacy, with (43.9±0.4)% of protoscolices still viable after 3 days of treatment. Protoscolex death increased with time. Only a small fraction of protoscolices were viable in cultures treated with 100 μmol/L celecoxib after 7 days.Although 100mol/L, 50μmol/L of celecoxib had an effect on protoscoleces，the effect was not as pronounced as that of 200 μmol/L of celecoxib. Treatment with celecoxib down-regulated that of ERK2 protein inEchinococcusgranulosusprotoscolices. The date reported in this article demonstrate a clearly that celecoxib satisfactory action againstE.granulosusprotoscolecesinvitro,this effect may relate to the inhibition of ERK2 kinase signaling pathway.

celecoxib；Echinococcusgranulosus；protoscoleces； ERK2 signal pathway

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. U1303121)資助

呂海龍，Email:lvhl1999@126.com

1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，石河子 832008; 2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，石河子 832008

Supported by the National Natural Science Foundation of China( No. U1303121)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.013

R383.33

A

1002-2694(2015)06-0556-04

2015-01-15；

2015-03-14