卷柏多糖抗腸道病毒71型活性及機制研究

夏燕平，馬騰，齊向云，李慶軍 ，王升啟 ，楊靜

1.河南中醫(yī)學院 藥學院，鄭州 河南 450008；2.軍事醫(yī)學科學院 放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850；

3.航天中心醫(yī)院 心臟病診療科，北京 100049

腸道病毒71型（enterovirus type 71，EV71）為單股正鏈RNA病毒，是小RNA病毒科腸道病毒屬A組腸道病毒，也是引起手足口病的主要病原體。與其他引起手足口病的腸道病毒不同之處在于EV71具神經嗜性，可引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和神經源性肺水腫等疾病[1]。目前，人類是EV71惟一已知的自然宿主[2]，5歲以下嬰幼兒為易感人群[3]。該病毒自1969年首次被報道以來，已經引發(fā)全球范圍內10多次暴發(fā)與流行，給人類特別是嬰幼兒健康造成了巨大的威脅[4]。中藥卷柏為卷柏科植物卷柏（Selagi?nella tamariscina）或墊狀卷柏的干燥全草，其性辛味平，具有活血通經、化瘀止血之功效[5]?，F代研究發(fā)現卷柏具有抗腫瘤[6～8]、抗病毒[9-10]、抗炎抑菌[11-13]、抗過敏[14]、降血糖[15]、抗氧化[16]和抗衰老[17]等諸多藥理活性。文獻報道卷柏抗病毒的有效成分主要為黃酮類[9-10]，而本實驗室前期研究發(fā)現卷柏多糖有很好的抗EV71導致的RD細胞病變效應，其中30%和50%醇沉卷柏多糖抑制作用顯著，80%和95%醇沉卷柏多糖抑制作用不明顯[18]。目前臨床上尚無特效的抗EV71藥物，主要采用對癥治療和利巴韋林等廣譜類抗病藥物。我們以利巴韋林為陽性對照[19]，通過噬斑法和細胞病變效應法（cytopathic effect，CPE）檢測了醇沉卷柏多糖在Vero細胞中的體外抗EV71活性，篩選出選擇指數（selection index，SI）最高的卷柏多糖醇沉部位，并初步探索其對EV71的直接殺滅作用及對病毒生活周期的影響，研究卷柏多糖抗病毒活性的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）由中國藥品與生物制品研究所贈送，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)液，在37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)，2 d傳代1次；EV71為國際標準BrCr株，由本實驗室于-70℃保存。

新鮮卷柏采自河南省西峽縣，制備方法參照文獻[18]：用10倍量水煮沸2 h，過濾；濾渣用8倍量水煮沸2 h，過濾；合并2次濾液，減壓濃縮至相對密度約1.1左右得總部位稠膏；用適量水溶解，依次用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，剩余部分低溫減壓濃縮，真空干燥得到水部位干燥物；取適量水部位干燥物水溶后用80%乙醇醇沉2次，過濾，沉淀先后用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，60℃真空干燥，得棕色卷柏多糖；多糖用適量水加熱溶解后，分別用30%、50%乙醇分級醇沉，得到30%、50%醇沉多糖。使用時用MEM培養(yǎng)液配制成10 g/L母液過濾除去濾渣，0.2 μm微孔濾膜過濾除菌，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

利巴韋林注射液（ribavirin，RBW）（國藥準字H19993467，批號12121312）為國藥集團榮生制藥有限公司產品；羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液（HEPES，1 mol/L）、雙抗（青霉素1×104U/mL，鏈霉素1×104μg/mL）和MEM培養(yǎng)液均購自邁晨生物科技公司；胎牛血清（FBS）為蘭州百靈生物技術有限公司產品；0.25%胰酶-EDTA和MEM干粉為GIBCO公司產品；甲基纖維素（MC）購自Sigma公司；細胞計數試劑盒（CCK8法）購自DoJoDo公司；病毒RNA提取試劑盒（DP315）和Quant One Step qRT-PCR（Probe）檢測試劑盒（KR113）購自天根生化科技（北京）有限公司；引物和探針序列均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

CO2細胞培養(yǎng)孵箱、生物安全柜和超凈工作臺均為Thermo Forma公司產品；mili-Q超純水系統(tǒng)為Millipore公司產品；倒置顯微鏡為Olympus公司產品；低溫高速離心機為Sigma公司產品；酶標儀（Model 680型）和熒光定量PCR儀（CFX96型）為Bio-Rad公司產品；細胞培養(yǎng)瓶為NUNC公司產品；0.22 μm針式滅菌濾器為PALL公司產品。

1.2 藥物對Vero細胞的毒性實驗

Vero細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，待次日細胞生長覆蓋率達70%～80%，將30%和50%醇沉卷柏多糖及RBW在0～4000 mg/L范圍內分別用含2%FBS的MEM培養(yǎng)液（維持液）稀釋至所需濃度后加入細胞，并設空白對照組，每組3個復孔，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h，鏡下觀察細胞形態(tài)變化，并用CCK8法檢測藥物對Vero細胞的毒性作用。

1.3 藥物對EV71致Vero細胞病變的影響實驗

Vero細胞接種于96孔板，待次日細胞生長覆蓋率達70%～80%，用EV71感染細胞（MOI=1），37℃、5%CO2條件下吸附1 h后吸棄病毒稀釋液，分別加入含不同濃度藥物的維持液，設空白對照組和病毒感染對照組，每組3個復孔，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h后收集細胞上清液于-20℃保存，同時用CCK8法檢測細胞活性。

1.4 噬斑法檢測藥物對培養(yǎng)液中EV71滴度的影響

Vero細胞接種于12孔板，待次日細胞生長覆蓋率達100%時，取上一步驟中收集的細胞培養(yǎng)上清液稀釋至1/10后感染細胞（400 μL/孔），37℃、5%CO2條件下吸附1 h后吸棄病毒稀釋液，加入營養(yǎng)覆蓋物（含1%MC、2%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的10 mmol/L的HEPES緩沖液），每日觀察噬斑情況，待噬斑不再增多且直徑較大時用4%甲醛溶液固定，1%結晶紫溶液染色。2×培養(yǎng)液的配制方法由本實驗室前期實驗摸索得到[19]。按下式計算噬斑數：

1.5 50%醇沉卷柏多糖對EV71的直接滅活作用[9]

用病毒稀釋液直接稀釋50%醇沉卷柏多糖（0、6.25、12.5、25、50和100 mg/L），37℃、5%CO2條件下共同孵育1、3、6 h，用噬斑法測定病毒滴度的變化。

1.6 50%醇沉卷柏多糖不同時間點加藥實驗[20-21]

Vero細胞接種于12孔板，待次日細胞生長覆蓋率達70%～80%，用EV71感染細胞（MOI=10），37℃、5%CO2條件下吸附1 h后吸棄病毒稀釋液，換成維持液繼續(xù)培養(yǎng)，分別在病毒感染的-1、0、1、3、6和9 h加藥，設空白對照組和病毒感染對照組，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h，觀察CPE并在鏡下拍照。

1.7 空斑法檢測50%醇沉卷柏多糖對病毒吸附環(huán)節(jié)的影響

參照文獻[21-22]設計50%醇沉卷柏多糖對病毒吸附環(huán)節(jié)的影響，其作用原理是病毒在4℃時基本上只吸附到細胞上而不穿入細胞內部。Vero細胞接種于12孔板，待次日細胞生長覆蓋率達100%時，4℃下放置2 h，病毒稀釋后與不同濃度的藥物預混，置冰上冷卻后接種細胞（400 μL/孔），置4℃繼續(xù)孵育1 h，用預冷的 PBS（pH7.3）洗 2 次，加入營養(yǎng)覆蓋物，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，噬斑法測定藥物對病毒滴度的影響。

1.8 空斑法檢測50%醇沉卷柏多糖對病毒進入環(huán)節(jié)的影響

Vero細胞接種于12孔板，待次日細胞生長覆蓋率達100%時，4℃放置2 h以上，病毒稀釋后（預先置冰上預冷）接種細胞，繼續(xù)置4℃孵育1 h，吸棄病毒稀釋液，用pH7.3的PBS洗2次，加入不同濃度的藥物，于37℃、5%CO2條件下分別孵育1 h，用pH11.0的堿性磷酸鹽緩沖液滅活病毒1 min，用pH3.0的酸性磷酸鹽緩沖液中和，棄中和液，用pH7.3的PBS洗1次，加入營養(yǎng)覆蓋物，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，噬斑法測定藥物對病毒滴度的影響[21-22]。

1.9 實時熒光定量PCR法檢測50%醇沉卷柏多糖對病毒復制和釋放環(huán)節(jié)的影響

Vero細胞接種于24孔培養(yǎng)板，待次日細胞生長覆蓋率達70%～80%，用EV71感染細胞（MOI=10），37℃、5%CO2條件下吸附1 h后棄病毒稀釋液，加入含不同濃度藥物（0、6.25、12.5、25、50 和 100 mg/L）的維持液，37℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)6、9和12 h后收集培養(yǎng)液和細胞。參照TIANamp Virus RNA Kit試劑盒操作說明書分別提取培養(yǎng)液和細胞中的RNA，用文獻[18]所述引物和探針，按照Quant One Step qRT-PCR（Probe）檢測試劑盒操作說明書進行實驗。反應體系為20 μL，反應條件為反轉錄（50℃）30 min，起始模板變性（92℃）3 min。擴增條件：92℃ 10 s，55℃ 20 s，68℃ 20 s，共40個循環(huán)。每個樣品重復3次，用構建的標準品做標準曲線，將得到的各組病毒RNA的拷貝數進行統(tǒng)計學分析。

1.10 統(tǒng)計學處理

所有實驗數據以x±s表示，用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。各實驗組與對照組樣本均數采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 藥物的細胞毒性

CCK8檢測結果顯示，在0～2000 mg/L濃度范圍內，30%和50%醇沉卷柏多糖未顯示出顯著的毒性作用；而RBW在62.5 mg/L濃度時細胞增殖開始受到抑制，隨著濃度的增大，細胞毒性增加（圖1）。計算三者對Vero細胞毒性的CC50（半數中毒濃度）分別為＞4000、＞4000和3908.3±8.15 mg/L。

2.2 不同濃度藥物對EV71致Vero細胞病變的影響

將不同濃度的30%和50%醇沉卷柏多糖及RBW加入EV71感染的Vero細胞中，48 h后檢測藥物對病毒CPE的影響，發(fā)現三者對EV71所致CPE抑制率最高分別可達88%、89%和66%（圖2）。計算三者的IC50（半數抑制濃度）分別為23.62±2.50、10.43±0.38 和 38.66±4.91 mg/L，SI分別為＞169、＞384 和101。其中RBW對病毒CPE的抑制作用與文獻[23]結果一致。

2.3 藥物對Vero細胞培養(yǎng)液中病毒滴度的影響

空斑實驗結果顯示，6.25～100 mg/L的30%和50%醇沉卷柏多糖均能顯著降低培養(yǎng)液中的病毒滴度（P＜0.01），并呈現劑量依賴；同等劑量的30%醇沉卷柏多糖抑制病毒滴度效果與RBW相當；同等劑量的50%醇沉卷柏多糖抑制病毒滴度的效果較RBW顯著增高（圖3）。

2.4 50%醇沉卷柏多糖對EV71的直接滅活作用

設置不同劑量的50%醇沉卷柏多糖與病毒共同孵育1、3、6 h后，噬斑法測定各組的病毒滴度，結果顯示各組間無統(tǒng)計學差異（圖4）。

2.5 50%醇沉卷柏多糖不同時間點加藥對EV71致Vero細胞病變的影響

圖1 不同濃度藥物對Vero細胞的毒性

圖2 不同濃度藥物抑制EV71致Vero細胞的CPE作用

在單復制周期水平上設計不同時間點加藥實驗，結果顯示提前1 h（-1 h）至感染后3 h加藥對病毒導致的Vero細胞病變均有抑制作用（圖5）。其中-1 h加藥和感染后0 h加藥（加入病毒的同時加入藥物，吸去病毒的同時吸去藥物）相當，說明50%醇沉卷柏多糖對EV71感染Vero細胞的預防環(huán)節(jié)不明顯；感染后0和1 h加藥明顯優(yōu)于感染后3 h加藥，說明50%醇沉卷柏多糖對EV71感染Vero細胞的早期環(huán)節(jié)（吸附或穿入）有明顯作用。感染后6和9 h加藥對EV71引起的細胞病變基本無作用，說明50%醇沉卷柏多糖對EV71感染Vero細胞的復制和釋放環(huán)節(jié)基本無影響。不同時間點加藥實驗只能初步說明藥物對EV71感染Vero細胞生活周期的影響，還須進一步驗證。

2.6 50%醇沉卷柏多糖對EV71感染Vero細胞吸附和進入環(huán)節(jié)的影響

圖3 各組培養(yǎng)液上清中的病毒滴度（x±s，n=3）**P＜0.01，與病毒感染對照組比較；##P＜0.01，與RBW組比較

藥物對病毒吸附影響實驗結果表明，25、50和100 mg/L劑量的50%醇沉卷柏多糖均能顯著降低病毒滴度（P＜0.05）（圖6A）；而藥物對病毒進入環(huán)節(jié)影響實驗結果顯示與病毒感染對照組對比無顯著性差異（圖6B）。

2.7 50%醇沉卷柏多糖對EV71復制和釋放環(huán)節(jié)的影響

根據文獻[24]設計實驗，檢測50%醇沉卷柏多糖是否通過抑制EV71的復制和釋放環(huán)節(jié)而具有抗病毒活性。結果顯示，與病毒感染對照組相比，各用藥組細胞內和細胞外檢測攻毒后6、9和12 h病毒RNA拷貝數均無顯著性差異，各用藥組的病毒RNA拷貝數胞內外比值無顯著性差異（圖7），說明50%醇沉卷柏多糖對EV71的復制和釋放環(huán)節(jié)無明顯作用。

3 討論

圖4 50%醇沉卷柏多糖與EV71共同孵育后測定的病毒滴度

圖5 50%醇沉卷柏多糖不同時間點加藥對EV71引起Vero細胞病變的抑制作用

本實驗室前期研究發(fā)現30%和50%醇沉卷柏多糖能夠顯著抑制EV71導致的RD細胞病變效應，本研究證明了30%和50%醇沉卷柏多糖能夠顯著抑制EV71導致的Vero細胞病變效應。針對中藥多糖類抗病毒作用機制，已見報道的有抑制病毒吸附[25]和增強宿主機體免疫功能[26]。EV71在活細胞內的生活周期約為12 h，其中病毒感染細胞后的前3 h主要是病毒吸附于宿主細胞上并進入細胞，第3～6 h病毒RNA開始大量復制，感染后第9 h病毒RNA拷貝數出現最高峰，感染后第12 h病毒顆粒基本包裝完成，進入大量釋放環(huán)節(jié)[20]。病毒感染復數（MOI）值越大，細胞增殖一代的周期相對越短，在較低MOI值的情況下，EV71的增殖動力學曲線相對較平緩[20]。我們根據病毒的生活周期設計實驗，探討卷柏多糖對EV71的直接滅活作用以及對EV71吸附、穿入、復制和釋放環(huán)節(jié)的作用。結果表明，50%醇沉卷柏多糖在體外不具有直接滅活病毒的作用；50%醇沉卷柏多糖濃度（＞25 mg/mL）與模型組比可顯著抑制EV71感染Vero細胞的吸附環(huán)節(jié)，對進入環(huán)節(jié)無影響，對EV71在Vero細胞中的復制和釋放環(huán)節(jié)無顯著抑制作用。

圖6 50%醇沉卷柏多糖對病毒吸附（A）和進入環(huán)節(jié)（B）的影響（x±s，n=3）*P＜0.05，**P＜0.01，與病毒感染對照組比較

圖7 50%醇沉卷柏多糖對EV71復制和釋放作用的影響A：培養(yǎng)液中病毒RNA拷貝數；B：細胞內病毒RNA拷貝數；C：培養(yǎng)液中RNA拷貝數占RNA總拷貝數的百分比

以上僅對卷柏多糖抗EV71的體外活性及其作用機制做了初步探索，體內藥效學作用研究還未完成。卷柏的有效成分為多糖，如能進一步闡明口服吸收是否會被胃腸道破壞、哪種給藥途徑最佳等問題，將為臨床應用該藥或其提取物防治EV71感染性疾病提供實驗依據，也可為抗EV71新藥的開發(fā)提供科學依據。這也是我們進一步研究的方向。

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