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    利用GST融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)與純化人N-Ras蛋白

    2015-11-29 04:16:20張云靜馮瀅瀅徐小潔梁迎春張立王濤李玲郭靖紀(jì)貝貝張蓉葉棋濃
    生物技術(shù)通訊 2015年4期
    關(guān)鍵詞:雙酶菌液基因突變

    張云靜 ,馮瀅瀅,徐小潔,梁迎春,張立,王濤,李玲,郭靖,紀(jì)貝貝,張蓉,葉棋濃

    1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100850;2.第二炮兵總醫(yī)院,北京 100088;3.總參警衛(wèi)局 衛(wèi)生保健處,北京 100017

    N-ras基因是由神經(jīng)母細(xì)胞瘤DNA 感染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH3T3 而發(fā)現(xiàn)的一種Ras基因,與H-Ras、K-Ras共同組成Ras基因家族。N-Ras基因位于人類1號染色體短臂(1p22-p32),內(nèi)部含有1個非編碼外顯子和4 個編碼外顯子,編碼相對分子質(zhì)量為21×103的蛋白單體(又稱為p21 蛋白)。Ras 蛋白是一種位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的信號傳遞小G 蛋白,具有GTP酶活性,在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用[1]。它是細(xì)胞信號傳遞中的“分子開關(guān)”,與GTP 結(jié)合為活化狀態(tài),與GDP 結(jié)合為失活狀態(tài),在細(xì)胞的分化與增殖中起重要作用。

    Ras基因為癌基因,點突變?yōu)槠涑R姷募せ罘绞?,約30%的惡性腫瘤存在Ras基因的突變[2]。Ras基因突變激活,其表達(dá)產(chǎn)物Ras 蛋白發(fā)生構(gòu)型改變,處于持續(xù)活化狀態(tài),使細(xì)胞增殖失去控制,導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[3]。不同Ras基因突變可以導(dǎo)致不同的腫瘤。研究發(fā)現(xiàn),N-Ras基因突變可導(dǎo)致髓系惡性腫瘤[4]、黑色素瘤[5]、甲狀腺腫瘤[6]、膀胱癌[7]、惡性膠質(zhì)瘤[8],研究N-Ras基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及演變過程中的作用有重要意義。為此,我們從人乳腺文庫中擴(kuò)增出N-Ras 蛋白的全長編碼序列,利用GST 融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)并純化NRas蛋白,為后續(xù)深入研究N-Ras基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的影響奠定了實驗基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    人乳腺文庫,大腸桿菌DH5α、Rossate 感受態(tài),原核表達(dá)載體pGEX-KG 為本室保存;高保真primer STAR DNA 聚合酶、BamHⅠ和XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶及其緩沖液、Taq酶為TaKa-Ra 公司產(chǎn)品;PCR 回收、膠回收、質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega 公司;GST-Sepharose 4B 購自Pharmacia公司;人GST 抗體購自Santa Cruz 公司;測序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

    1.2 人N-Ras蛋白全長編碼區(qū)基因的擴(kuò)增

    根據(jù)NCBI 查詢的人N-Ras 編碼序列合成上游引物(5'-CGGGATCCATGACTGAGTACAAACTGGT GGTG-3')和下游引物(5'-CCGCTCGAGTTACATC ACCACACATGGCAATCC-3'),利用PCR 方法,用高保真primer STAR DNA 聚合酶從人乳腺文庫中擴(kuò)增人N-Ras 編碼序列。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸60 s,30 個循環(huán),72℃延長7 min。PCR 結(jié)束后,行瓊脂糖凝膠電泳,將位置正確的特異條帶用膠回收試劑盒回收。

    1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定

    將pGEX-KG 載體用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切,經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后,膠回收載體大片段;用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切PCR 回收產(chǎn)物,使其形成帶黏端的雙鏈;用T4DNA 連接酶將其連接入pGEXKG 載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑選陽性克隆,振蕩培養(yǎng)并提質(zhì)粒,用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定,酶切鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測序。

    1.4 融合蛋白GST-N-Ras 在大腸桿菌中的小量誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

    將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossate 感受態(tài)細(xì)胞,挑取菌落至含有氨芐西林的LB 液體試管中,37℃振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.6~1.0,取500μL 菌液用于保菌,取500μL 菌液離心收集菌體作為誘導(dǎo)前對照,剩余菌液中加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L,37℃繼續(xù)培養(yǎng)4~6 h,取500μL菌液離心收集菌體作為誘導(dǎo)后樣品,進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

    1.5 融合蛋白GST-N-Ras的純化與洗脫

    將小量誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定正確的Rossate 菌接種于含氨芐西林的LB 液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜活化,按10%的比例轉(zhuǎn)種于同種液體培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.4~0.6,加入IPTG 至終濃度為0.1 mmol/L,于20℃溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)16~20 h,4℃、10 000 r/min 離心10 min 后收集菌體,加入裂解液,吹勻后冰浴30 min,用超聲波儀破碎菌體,4℃、10 000 r/min 離心10 min 后收集上清,加入200μL GST-Sepharose 4B 結(jié) 合4 h,離心收 集GST-Sepharose 4B 小顆粒,充分洗脫后即為結(jié)合蛋白質(zhì)。利用還原性谷胱甘肽小量多次地將GST-NRas 從珠子上逐漸洗脫,最后經(jīng)SDS-PAGE 鑒定純化與洗脫的蛋白。

    2 結(jié)果

    2.1 人N-Ras編碼區(qū)基因的克隆

    以人乳腺文庫為模板,PCR 擴(kuò)增N-Ras 編碼區(qū)全長序列,獲得與預(yù)期片段大小一致的600 bp 左右的PCR產(chǎn)物(圖1)。

    2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

    用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pGEX-KG 載體,膠回收較大片段;將PCR 產(chǎn)物用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后膠回收;用T4DNA 連接酶及其緩沖液將上述2片段連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,挑克隆,利用Taq酶行菌液PCR,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,條帶大小約為600 bp 者為陽性克?。▓D2);將陽性克隆提質(zhì)粒,用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定,如在600 bp 左右出現(xiàn)特異條帶(圖3),表明N-Ras 的編碼序列已成功插入pGEX-KG 上游的多克隆位點中。經(jīng)DNA 序列測定,該序列與已知序列完全一致,無突變發(fā)生(序列數(shù)據(jù)略)。

    2.3 融合蛋白GST-N-Ras的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

    將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rossate 感受態(tài)細(xì)胞,挑取菌落至含氨芐西林的LB 液體試管中,37℃振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.6~1.0,取500μL 菌液離心收集菌體作為誘導(dǎo)前對照,后加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L,37℃培養(yǎng)4~6 h,取500μL 菌液離心收集菌體作為誘導(dǎo)后樣品,行SDS-PAGE,發(fā)現(xiàn)GST-N-Ras融合蛋白獲得正確表達(dá)(圖4)。

    圖1 N-Ras基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

    2.4 融合蛋白GST-N-Ras的純化與洗脫

    用GST-Sepharose 4B 親和珠純化得到融合蛋白,經(jīng)還原性谷胱甘肽小量多次洗脫,考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示獲得一定量的純度較高的GST-N-Ras(圖5)。

    3 討論

    Ras家族有三大成員,即K-Ras、H-Ras和NRas。目前,研究報道比較多、機(jī)制相對較明確的是K-Ras對腫瘤細(xì)胞的影響及耐藥性的研究,而對于N-Ras基因與腫瘤的報道相對較少。Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/PTEN 信號傳導(dǎo)通路對細(xì)胞的生長、繁殖與分化具有重要意義[9-13],而N-Ras基因是該信號通路中重要的調(diào)控因子,N-Ras基因的突變可致細(xì)胞持續(xù)生長,甚至腫瘤發(fā)生[5]。

    圖2 重組質(zhì)粒的菌液PCR結(jié)果電泳圖譜

    圖3 重組質(zhì)粒的BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定

    有研究報道,N-Ras第61 位密碼子發(fā)生點突變占所有Ras突變的67%~88%[14-15],而且不同腫瘤組織中N-Ras基因的表達(dá)率不同[16]。Colombino 等[17]報道,在15%N-Ras基因突變的黑色素瘤患者中,黑色素瘤細(xì)胞增殖與N-Ras基因密切相關(guān),隨著黑色素瘤細(xì)胞的增殖,細(xì)胞內(nèi)N-Ras的蛋白和mRNA 水平顯著增加。在甲狀腺濾泡狀癌中,N-Ras第61 位密碼子發(fā)生點突變是比較普遍的(突變率26.8%),這種突變的發(fā)生為臨床上更為精確地診斷甲狀腺癌提供了證據(jù),同時也能預(yù)測甲狀腺濾泡狀癌的危險程度[18]。在急性髓系白血病[4]、多發(fā)性骨髓瘤[19]患者中也存在N-Ras突變的情況,其機(jī)制可能是由于突變導(dǎo)致編碼的Ras 蛋白構(gòu)型改變,使其處于功能持續(xù)活化狀態(tài),從而激活了Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT等下游信號傳導(dǎo)通路,最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生,但具體機(jī)制還有待于繼續(xù)深入研究。也有個案報道,在原發(fā)性腦間質(zhì)腫瘤、痣同時伴有神經(jīng)與皮膚惡性黑色素瘤患者中,發(fā)現(xiàn)存在N-Ras基因第13 位密碼子的突變,這可能是多種因素作用的結(jié)果,研究者推斷與RAF-MEK-ERK、RalGDS、PI3K-AKT/PDK1和PLC/PKC 信號通路有關(guān),具體機(jī)制需要深入研究[20]。盡管有充足的實驗數(shù)據(jù)證明N-Ras基因突變與多種腫瘤的進(jìn)展、惡性轉(zhuǎn)化及預(yù)后密切相關(guān),但其具體作用機(jī)制、臨床上的指導(dǎo)意義及其耐藥性還不是十分清楚,為我們進(jìn)一步深入研究指明了方向。

    綜上,我們利用原核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)了重組蛋白GST-N-Ras,并用Sepharose-4B 珠子對重組蛋白進(jìn)行了純化,為后續(xù)深入研究N-Ras基因影響腫瘤細(xì)胞的具體機(jī)制奠定了實驗基礎(chǔ)。

    圖4 GST-N-Ras融合蛋白的SDS-PAGE分析

    圖5 GST-N-Ras融合蛋白純化并洗脫后的SDS-PAGE分析

    [1]Vakiani E,Solit D B.KRAS and BRAF:drug targets and predictive biomarkers[J].J Pathol,2011,223(2):219-229.

    [2]Yu S H,Wang T H,Au L C.Specific repression of mutant K-RAS by 10-23 DNAzyme:Sensitizing cancer cell to anticancer therapies[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,378(2):230-234.

    [3]胡成久.RAS 基因及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與皮膚腫瘤關(guān)系[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報,2012,25(7):771-773.

    [4]楊建剛,孫雪梅,顧香芳,等.急性髓系白血病中N-RAS 基因點突變的檢測以及信號傳導(dǎo)通路蛋白的表達(dá)[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué),2009,37(4):273-277.

    [5]周啟明,趙艷,陳倩琪,等.BRAF和NRAS 基因表達(dá)與黑色素瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)性分析[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2013,19(8):1023-1030.

    [6]吳遠(yuǎn)昊,張守鵬.RAS 基因突變在甲狀腺癌中的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)學(xué)工程,2012,20(8):185-186.

    [7]Przybojewska B,Jagiello A,Jalmuzna P.H-RAS,K-RAS,and N-RAS gene activation in human bladder cancers[J].Cancer Genet Cytogenet,2000,121(1):73-77.

    [8]Knobbe C B,Reifenberger J,Reifenberger G.Mutation analysis of the Ras pathway genes NRAS,HRAS,KRAS and BRAF in glioblastomas[J].Acta Neuropathol,2004,108(6):467-470.

    [9]Hou W,Liu J,Chen P,et al.Mutation analysis of key genes in RAS/RAF and PI3K/PTEN pathways in Chinese patients with hepatocellular carcinoma[J],Oncol Lett,2014,8(3):1249-1254.

    [10]McCubrey J A,Steelman L S,Chappell W H,et al.Ras/Raf/MEK/ERK and PI3K/PTEN/Akt/mTOR cascade inhibitors:how mutations can result in therapy resistance and how to overcome resistance[J].Oncotarget,2012,3(10):1068-1111.

    [11]Therkildsen C,Bergmann T K,Henrichsen-Schnack T,et al.The predictive value of KRAS,NRAS,BRAF,PIK3CA and PTEN for anti-EGFR treatment in metastatic colorectal cancer:a systematic review and meta-analysis[J].Acta Oncol,2014,53(7):852-864.

    [12]Kleist B,Kempa M,Novy M,et al.Comparison of neuroendocrine differentiation and KRAS/NRAS/BRAF/PIK3CA/TP53 mutation status in primary and metastatic colorectal cancer[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(9):5927-5939.

    [13]Wong C W,Fan Y S,Chan T L,et al.BRAF and NRAS mutations are uncommon in melanomas arising in diverse internal organs [J].J Clin Pathol,2005,58(6):640-644.

    [14]Liu R T,Hou C Y,You H L,et al.Selective occurrence of ras mutations in benign and malignant thyroid follicular neoplasms in Taiwan[J].Thyroid,2004,14(8):616-621.

    [15]Vasko V,Ferrand M,Di Cristofaro J,et al.Specific pattern of RAS oncogene mutations in follicular thyroid tumors[J].J Clin Endocrinol Metab,2003,88(6):2745-2752.

    [16]陳凱,齊瑞群,高興華,等.惡性黑素瘤和色素痣中PI3K、AKT、NRAS和ERK 的表達(dá)及其意義[J].青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2009,30(2):114-117.

    [17]Colombino M,Capone M,Lissia A,et al.BRAF/NRAS mutation frequencies among primary tumors and metastases in patients with melanoma[J].J Clin Oncol,2012,30(20):2522-2529.

    [18]Bae J S,Choi S K,Jeon S,et al.Impact of NRAS mutations on the diagnosis of follicular neoplasm of the thyroid[J].Int J Endocrinol,2014,2014:289834.

    [19]林克勤,賀振新,楊凌,等.多發(fā)性骨髓瘤骨髓RAS 基因突變檢測分析[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20(9):691-694.

    [20]Shih F,Yip S,McDonald P J,et al.Oncogenic codon 13 NRAS mutation in a primary mesenchymal brain neoplasm and nevus of a child with neurocutaneous melanosis[J].Acta Neuropathol Commun,2014,2(1):140.

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