鼠疫耶爾森菌F1-V 融合蛋白改構(gòu)體的構(gòu)建、原核表達及純化

房婷，尹可欣，任軍，張曉鵬，于蕊，宋小紅，楊秀旭，于長明

軍事醫(yī)學科學院科學院 生物工程研究所，北京 100071

鼠疫也稱黑死病，是由鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis）引起的烈性傳染病，主要的寄主和傳染源為嚙齒類動物[1]。感染鼠疫菌主要有3 種類型，即腺鼠疫、肺鼠疫和敗血癥鼠疫。其中肺鼠疫病程急、致死率高，肺鼠疫患者咳嗽產(chǎn)生的帶菌飛沫可經(jīng)呼吸道途徑發(fā)生人-人傳播，導致更加嚴重的人間鼠疫[2-4]。

進入20世紀90年代后，鼠疫疫情逐漸活躍的趨勢更加明顯，鼠疫被WHO 確定為重新流行的20 種傳染病之一。鼠疫治療目前以抗生素治療為主，雖早期給予足量抗生素的治療效果良好，但副作用較大，且已發(fā)現(xiàn)耐藥鼠疫菌菌株[3,5]。因此，鼠疫的預(yù)防成為關(guān)鍵，研究鼠疫疫苗具有重要意義。傳統(tǒng)鼠疫疫苗有全菌體滅活疫苗（如美國使用的鼠疫USP 死菌苗）及減毒活疫苗（如中國和其他幾個國家正在使用的EV76 減毒活疫苗）等，但上述疫苗存在副作用大、免疫次數(shù)多、保護時間短，且無法防護通過氣溶膠傳播的肺鼠疫等一系列問題[6-7]。而重組亞單位疫苗克服了傳統(tǒng)疫苗的許多缺陷，不含感染組分，無致病性，且具有在體內(nèi)不復(fù)制的優(yōu)點，因此，亞單位疫苗成為當前鼠疫疫苗研究的熱點。目前鼠疫亞單位疫苗主要有以下4 種形式：F1 莢膜抗原（F1 抗原）、V抗原、以一定比例混合的F1抗原+V抗原、F1-V融合蛋白，其中后者不僅可以有效防護腺鼠疫，而且可以有效阻止肺鼠疫的發(fā)生[8-12]。

上述疫苗最大的問題在于，F(xiàn)1 的天然功能是其在鼠疫菌外膜聚集成寡聚蛋白，形成膠樣顆粒層、水溶性的莢膜物質(zhì)。這種天然屬性會造成其易于形成不均一的聚集體。雖然無論是完整形式的F1 聚合體還是F1 解聚后的單體都具有免疫原性，但這會為疫苗生產(chǎn)的質(zhì)量控制帶來問題[13-15]。而且用F1和V構(gòu)建的融合蛋白重組F1-V（rF1-V）也無法避免目的蛋白的無規(guī)則聚集，導致純化后的rF1-V 相對分子質(zhì)量從53 061 到1.5×107間均有分布[11]。在本研究中，我們根據(jù)F1 的結(jié)構(gòu)特點對其序列進行改構(gòu)，將N 端1～14位氨基酸移到C 端，再將其與V 蛋白融合，形成穩(wěn)定、均一的單體形式融合蛋白，鑒定正確后，使之在大腸桿菌中高效表達，然后摸索了純化方法，并對純化產(chǎn)物進行了檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

感受態(tài)大腸桿菌Top10、BL21（DE3）購自天根公司；質(zhì)粒pET-32a（+）購自Novagen 公司，pET42a-VF1 為本室保存；限制性內(nèi)切酶購自NEB 公司；Pyrobest DNA 聚合酶、ExTaqDNA 聚合酶、T4DNA 連接酶等購自TaKaRa 公司；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購自Qiagen 公司；PageRuler Prestained Protein Ladder 購 自Thermo 公 司；蛋 白marker 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；離子交換填料Source30 Q、疏水填料Phenyl Sepharose High Performance（裝于XK 26/20 柱殼）、凝膠過濾預(yù)裝柱HiLoad 26/60 Superdex 75 prep grade 均購自GE Healthcare 公司；抗小鼠IgG-HRP 為Santa Cruze公司產(chǎn)品；細菌內(nèi)毒素標準品購自廈門鱟試劑實驗廠有限公司；氨芐西林（Amp）為華北制藥廠產(chǎn)品；抗V和抗F1單克隆抗體購自Abcam公司。

低溫高速離心機購自Beckman Coulter 公司；SDS-PAGE 電泳儀為BIO-RAD 公司產(chǎn)品；Image Quant LAS4000mini 成像系統(tǒng)和純化儀AKTA EXPLORER均為GE Healthcare公司產(chǎn)品；酶標儀Spectra Max Paradigm 為Molecular Devices公司產(chǎn)品。

1.2 目的基因的PCR擴增及產(chǎn)物純化

引物設(shè)計見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以pET42a-VF1 為模板，PCR 分別擴增V及F1mut片段。第一輪PCR 用引物F1mutF1和F1mutR1，去掉F1 分子N 端的1～14 位氨基酸對應(yīng)的堿基序列，并在核酸序列的5'端引入NdeⅠ酶切位點，得到F1mut1；用引物VF和VR，在V基因序列的5'端引入BamHⅠ酶切位點，3'端引入終止密碼子和NotⅠ酶切位點，得到V序列。第二輪PCR 用引物F1mutF1、F1mutR2，以F1mut1為模板，在其3'端引入F1 分子N 端1～14 位氨基酸對應(yīng)的堿基序列，用SA 連接，得到F1mut2序列。第三輪PCR 用引物F1mutF1、F1mutR3，以F1mut2為模板，在其3'端引入F1 分子N 端15～21 位氨基酸對應(yīng)的堿基序列和BamHⅠ酶切位點，最終得到F1mut片段。PCR 產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳分析，并用瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒純化。

1.3 表達載體的構(gòu)建及鑒定

將純化的PCR 產(chǎn)物首先進行加A 反應(yīng)，將加A產(chǎn)物與pMD18-T 連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)，用菌落PCR 鑒定重組質(zhì)粒，陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進行DNA測序分析。

將測序正確的質(zhì)粒pMD18-T-F1mut和pMD18-T-V 分別用NdeⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/NotⅠ雙酶切，片段回收后與pET-32a 載體連接轉(zhuǎn)化，37℃培養(yǎng)，挑取單菌落，菌落PCR 鑒定，將陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進行DNA 測序分析，測序正確的陽性pET-32a-F1mut-V 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞。

1.4 rF1mut-V的誘導表達

從平板上挑取獲得的改構(gòu)體工程菌的單菌落，接種于5 mL 含100 mg/mL Amp 的LB 培養(yǎng)液中，37℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，次日以1∶100的比例轉(zhuǎn)接到含Amp 的LB 培養(yǎng)液中，37℃、220 r/min 培養(yǎng)至對數(shù)生長中期（D600nm約為0.6），加入終濃度為50μmol/L 的IPTG，25℃誘導5 h，15% SDS-PAGE 鑒定誘導表達情況。

表1 引物及序列

1.5 分級硫酸銨沉淀

發(fā)酵料液于4℃、8000 r/min 離心10 min，棄上清，收集菌體沉淀，每克菌體加入10 mL 緩沖液A（50 mmol/L Tris，2 mmol/L EDTA，5%甘油，pH9.0）重懸，冰浴超聲波破碎菌體，4℃、12 000 r/min 離心30 min，收集上清，加入終濃度為60%的硫酸銨，冰浴攪拌30 min，10 000 r/min 離心30 min，棄上清，沉淀用緩沖液A洗3次后重懸，用0.45μm的濾膜過濾后待用。

1.6 陰離子交換層析

采用Source 30Q 陰離子交換柱（XK26/20 柱體積CV=20 mL），用平衡緩沖液A 平衡后上樣，繼續(xù)用緩沖液A 淋洗至基線，再采用線性梯度30%B 10CV 洗脫，B 泵為緩沖液B（50 mmol/L Tris，1 mol/L NaCl，pH9.0），根據(jù)SDS-PAGE 收集合并目的蛋白組分，進入下一步純化。

1.7 Phenyl疏水層析

收集液先用NaCl 母液（50 mmol/L Tris，4 mol/L NaCl，pH9.0）調(diào)節(jié)電導后，4℃、10 000 r/min 離心30 min。采用Phenyl HP 疏水交換柱（XK26/20柱體積CV=20 mL），用平衡緩沖液C（50 mmol/L Tris，2 mol/L NaCl，pH9.0）平衡后上樣，繼續(xù)用緩沖液C 淋洗至基線，再采用線性梯度100%B 10CV 洗脫，B 泵為緩沖液D（50 mmol/L Tris，pH9.0），根據(jù)SDSPAGE收集合并目的蛋白組分，進入下一步純化。

1.8 凝膠過濾層析

采用凝膠過濾預(yù)裝柱HiLoad 26/60 Superdex 75 prep grade（CV=318 mL），緩沖液為E（20 mmol/L PB，0.15 mol/L NaCl，pH7.2），將目的蛋白進行精純的同時完成緩沖液的置換，根據(jù)SDS-PAGE 收集合并目的蛋白組分。

1.9 rF1mut-V的鑒定

將純化的rF1mut-V，本室制備的重組F1、V 蛋白，沒有改構(gòu)的重組F1-V 蛋白分別加入5×SDSPAGE 加樣緩沖液，100℃變性5 min，離心，行15%SDS-PAGE，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，化學發(fā)光法顯色，用Image Quant LAS4000mini化學發(fā)光成像系統(tǒng)曝光。

非還原型SDS-PAGE 用于檢測蛋白純度，上樣量為10μg，將SDS-PAGE 結(jié)果經(jīng)掃描儀掃描后，用Bandscan軟件分析純度。內(nèi)毒素測定采用凝膠限度試驗，方法見2010 年版《中華人民共和國藥典》三部附錄ⅫE）。結(jié)果判定，凝固為內(nèi)毒素陽性，未凝固為內(nèi)毒素陰性。檢測靈敏度為0.5 EU/mL。

2 結(jié)果

2.1 F1mut改構(gòu)體三級結(jié)構(gòu)模擬

將F1和F1mut 的序列提交到SWISS-MODEL服務(wù)器（http://swissmodel.expasy.org/），模擬結(jié)果見圖1。由圖1A、B可以看到F1的三級結(jié)構(gòu)主要是由4個反向平行的β折疊形成類似三明治結(jié)構(gòu)，疏水核心部分暴露在一個狹長的疏水深裂中。其中一個F1蛋白的3個β折疊形成上述縫隙，而另一個F1蛋白N端的β折疊作為“供體”嵌入該縫隙中，最終形成高分子量的線性F1 纖維結(jié)構(gòu)。但該結(jié)構(gòu)在形成過程中需要外膜引導蛋白Caf1A和伴侶蛋白Caf1M 的共同作用，引導F1 蛋白的正確折疊[16-18]。而在外源系統(tǒng)中過度表達F1 抗原時，由于缺失Caf1A和Caf1M，F(xiàn)1會形成不可控的聚集，并容易形成包涵體。

我們將N 端1～14 個氨基酸轉(zhuǎn)移到C 端，以期單獨的F1mut 蛋白即可形成上述三明治結(jié)構(gòu)（圖1C、D），因此在外源系統(tǒng)表達該蛋白時，不再需要Caf1A和Caf1M即可形成可溶的單體結(jié)構(gòu)。

2.2 目的基因的PCR擴增

10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳表明擴增產(chǎn)物與F1mut及V基因大小相符，分別約為486和992 bp（圖2）。

2.3 克隆載體pMD18-T-F1mut和pMD18-T-V 的菌落PCR鑒定

PCR 獲取F1mut及V基因片段后，將其克隆到pMD18-T 載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，菌落PCR 鑒定，并對陽性克隆進行測序分析。結(jié)果表明陽性克隆的基因片段長度及測序結(jié)果與F1mut及V基因一致（圖3、4）。

2.4 pET-32a-F1mut-V原核表達載體的構(gòu)建及鑒定

圖1 通過SWISS-MODEL預(yù)測的F1和F1mut的三級結(jié)構(gòu)模型

pET-32a 雙酶切載體片段依次與pMD18-TF1mut和pMD18-T-V 克隆載體的雙酶切回收的基因片段（圖5）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10 感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)后挑取單菌落培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR 鑒定可看到部分克隆擴增到約1500 bp的目的條帶（圖6）。

2.5 rF1mut-V改構(gòu)體的表達與純化

將發(fā)酵液離心重懸后超聲波裂解，離心收集上清、沉淀，等體積重懸。上清采用硫酸銨分級沉淀，在60%飽和硫酸銨時離心分離上清、沉淀，沉淀用上樣緩沖液清洗后重懸，目的蛋白絕大部分被沉淀下來，純度提高到60%以上（圖7A），隨后經(jīng)Source 30Q、Phenyl HP和Superdex 75 三步層析柱純化，目的蛋白純度達95%以上。但目前經(jīng)硫酸銨分級沉淀后發(fā)現(xiàn)仍然存在二聚體形式，經(jīng)上述三步純化，尤其是Superdex 75，可將單體和二聚體完全分開（圖7D）。

2.6 rF1mut-V的初步鑒定

圖2 PCR擴增F1mut1、F1mut2、F1mut及V基因

圖3 pMD18-T-F1mut轉(zhuǎn)化TOP10的菌落PCR鑒定

圖4 pMD18-T-V轉(zhuǎn)化TOP10的菌落PCR鑒定

將純化后的蛋白分別進行純度、濃度、內(nèi)毒素檢測和Western 印跡。Western 印跡使用本室制備的rF1、rV和未改構(gòu)的rF1-V 抗原為陽性對照，結(jié)果表明rF1mut-V 抗原與抗V、F1 抗體均有特異性結(jié)合（圖8）。同時將本室制備的rF1-V、rF1、rV和rF1mut-V 分別進行非還原和還原型SDS-PAGE（圖9），發(fā)現(xiàn)rF1、rV和未改構(gòu)的rF1-V 均有不同程度的聚集，尤其是rF1和rF1-V 的聚集體呈不均一分布，但都可被還原為均一的單體形式。相比于rF1-V，rF1mut-V 主要有單體和二聚體形式，且還原后相對分子質(zhì)量與rF1-V 的單體一致。從圖9 還可以看出rV 抗原在非還原狀態(tài)下存在二聚體，由于rF1mut-V僅對F1 序列進行改構(gòu)，而保留了天然V 抗原第273位的半胱氨酸位點，這會導致rF1mut-V 產(chǎn)生同V 抗原一樣的分子間二硫鍵，從而形成同源二聚體[19]。

用Bandscan 軟件分析非還原型SDS-PAGE 結(jié)果，純度大于95%。內(nèi)毒素含量檢測表明陰性對照及各樣品均為陰性，陽性對照為陽性。

3 討論

目前鼠疫亞單位疫苗的主要候選抗原為F1 抗原、V 抗原、鼠疫菌外膜蛋白（Y.pestisouter membrane protein，Yops）和纖溶酶原激活物/凝固酶（plasminogen activator/coagulase，Pla）。其中，由英國PharmAthene UK Limited 研發(fā)的rF1+rV 疫苗、美國DynPort Vaccine Company LLC 研發(fā)的rF1-V 融合蛋白疫苗均已進入臨床試驗階段（ClinicalTrials.gov Identifier：NCT00246467，NCT00332956），但目前還沒有一種重組亞單位疫苗獲批上市，這與之前描述的F1 抗原天然結(jié)構(gòu)造成的缺陷不無關(guān)系，因為其會為產(chǎn)品質(zhì)控和大規(guī)模生產(chǎn)帶來巨大挑戰(zhàn)。

圖5 pMD18-T-F1mut和pMD18-T-V質(zhì)粒的酶切鑒定

圖6 pET-32a-F1mut-V轉(zhuǎn)化Top10的菌落PCR鑒定

圖7 rF1mut-V純化過程分析圖

圖8 Western印跡圖譜

本研究在基因水平上對F1 的結(jié)構(gòu)進行改變，通過3輪PCR，將F1蛋白N端前14個氨基酸移到C端，然后將改構(gòu)的F1mut 與V 蛋白融合表達，得到了序列正確且能夠可溶表達的重組F1mut-V 融合蛋白，目的蛋白占全菌蛋白的25%以上。這為后期大規(guī)模生產(chǎn)奠定了良好基礎(chǔ)，省卻了繁瑣且容易造成蛋白失活的變性-復(fù)性過程。經(jīng)過硫酸銨分級沉淀、陰離子交換層析、疏水相互作用層析和凝膠過濾層析，分別得到了純度符合要求的rF1mut-V 單體和二聚體。在純化中，均采用商品化的層析填料，并且純化流程銜接順暢，不需要換液、稀釋等中間步驟，便于操作和放大。并進行了Western印跡鑒定，證明融合蛋白與天然結(jié)構(gòu)的rF1-V 一樣，均與F1、V 抗原有特異性結(jié)合。但相比于rF1-V，改構(gòu)后rF1mut-V 的性質(zhì)更為穩(wěn)定，不會發(fā)生如圖9 所示的不規(guī)則聚集。雖然凍干、低溫保存、加入還原劑等手段可以在生產(chǎn)重組F1-V融合蛋白的過程中抑制聚集的發(fā)生，但一旦鹽濃度提高、溫度改變劇烈或去除還原劑，不可控的聚集很快就會發(fā)生，甚至有可能會導致沉淀[11]。因此，rF1mut-V 有望成為新一代亞單位疫苗的有效成分。

圖9 抗原的SDS-PAGE圖譜

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