血吸蟲蟲卵在BALB/c鼠各組織中的分布

許 瑞，趙登云，林矯矯，劉金明,陸 珂，洪 煬，李 浩，劉迎春，劉一平，徐玉梅,朱傳剛

血吸蟲蟲卵在BALB/c鼠各組織中的分布

許 瑞1，趙登云1，林矯矯1，劉金明1,陸 珂1，洪 煬1，李 浩1，劉迎春1，劉一平2，徐玉梅3,朱傳剛1

目的 研究血吸蟲感染BALB/c鼠后，蟲卵在其部分組織中特別是在腸壁中的分布狀況。方法 10只BALB/c鼠腹部貼片感染血吸蟲尾蚴(40±1條/只)，感染42 d后剖殺，分別取鼠的肝臟、脾臟、腸道(小腸上段、中段、下段、盲結(jié)腸、直腸)進行成蟲計數(shù)、蟲卵計數(shù)、毛蚴孵化、組織切片觀察，并將得到的結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果 血吸蟲蟲卵在BALB/c鼠各組織的分布為：肝臟(59.64%)、脾臟(0.81%)、小腸上段(6.27%)、小腸中段(5.24%)、小腸下段(5.14%)、盲結(jié)腸(17.48%)、直腸(5.41%)，肝臟的沉積蟲卵數(shù)和孵化數(shù)與其他組織相比差異顯著，腸組織中大腸段比小腸段的沉積蟲卵數(shù)和孵化數(shù)多且差異顯著。在孵化率的比較中肝臟的孵化率最高(1.09%)。病理切片觀察，肝臟產(chǎn)生大量肉芽腫結(jié)節(jié)，腸壁出現(xiàn)不同程度的炎癥壞死。結(jié)論 BALB/c鼠定量人工感染血吸蟲后，肝臟中的沉積蟲卵最多，其次是盲結(jié)腸，最少的是脾臟；且不同組織的沉積蟲卵數(shù)目與病理損傷程度有關(guān)。

血吸蟲；BALB/c鼠；組織分布；沉積蟲卵

血吸蟲病是一種嚴重危害人類健康和影響社會發(fā)展進步的慢性傳染病，主要分布在包括中國在內(nèi)的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。血吸蟲蟲卵在血吸蟲病的傳播流行方面起著重要作用，是傳播血吸蟲病的重要因素。蟲卵隨哺乳動物糞便排出，一旦污染水源，糞便中的血吸蟲卵就能在適宜的條件下孵出毛蚴，若水中有釘螺，則導(dǎo)致釘螺的感染，人或家畜在有陽性釘螺的地區(qū)活動并接觸疫水，很容易感染血吸蟲病[2]。

血吸蟲成蟲寄生于人或其他哺乳類動物的腸系膜下靜脈，合抱的雌雄蟲交配產(chǎn)卵于小靜脈的小分支，部分蟲卵附著于腸壁血管內(nèi)和周圍組織，另一部分蟲卵隨血流經(jīng)肝門靜脈沉積于肝，在門管區(qū)等處形成蟲卵結(jié)節(jié)，故在肝表面和切面可見粟?；蚓G豆大結(jié)節(jié)[3]。分布在腸腔組織的蟲卵引起腸壁免疫反應(yīng)形成病變和潰口，蟲卵可經(jīng)此進入腸腔，隨糞便排出體外。蟲卵是引起宿主組織發(fā)生病變的最重要因素，蟲卵引起的病變與蟲卵在各組織器官中沉積的數(shù)量密切相關(guān)。本論文以人工感染的BALB/c小鼠為模型探索血吸蟲蟲卵在小鼠肝、脾和腸各段中的具體分布的數(shù)量關(guān)系以及蟲卵孵化成毛蚴的能力，并對各組織產(chǎn)生的病理損傷進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡SPF級BALB/c小鼠，雄性，體重20～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。

1.1.2 血吸蟲蟲種 陽性釘螺由江蘇省寄生蟲病研究所購進，實驗室人工培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的感染與取樣 將10只小鼠按常規(guī)腹部貼片感染血吸蟲尾蚴(40±1條/只)，感染后第42 d解剖，取各鼠的肝、脾、腸，將腸根據(jù)功能細分成小腸、盲結(jié)腸、直腸3段，其中小腸再細分成上、中、下3段(每段約18 cm)，清空腸道內(nèi)容物。

1.2.2 不同組織成蟲的計數(shù) 仔細分離各組織周圍的血管，用眼科鑷挑取各組織部位血管中的成蟲，并計數(shù)。

1.2.3 各組織的處理 仔細分離除去粘附于各組織的血管、腸系膜等外在組織，分別稱重后放入離心管中，加適量的蒸餾水，定容至10 mL，用高速勻漿機處理，得到各組織的勻漿。

1.2.4 毛蚴的孵化與計數(shù) 將孵化瓶中加蒸餾水至瓶頸處，加入5 mL上述勻漿，在瓶口水面處塞入疏松脫脂棉。再緩慢加入10 mL蒸餾水，靜置孵化2 h后，吸取棉層上部液體加甲醛固定過夜后收集毛蚴，用碘酒染色，解剖鏡下計數(shù)。

1.2.5 蟲卵的消化與計數(shù) 取800 μL的組織勻漿于2 mL的EP管中，再加入800 μL的20%NaOH溶液，37 ℃的條件下消化2 h，4 ℃保存，每次取100 μL消化液，用計數(shù)板計數(shù)其蟲卵數(shù)，每樣計數(shù)3次。

1.2.6 制備組織切片 將肝臟、脾臟、小腸上段、小腸中段、小腸下段、盲腸、結(jié)腸和直腸組織修塊，放入EP管中，并加入10%的甲醛溶液固定，然后進行石蠟包埋，切片并進行HE染色，顯微鏡下觀察。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計算算數(shù)平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)偏差。同時比較組間差異。內(nèi)臟沉積蟲卵百分比的計算：記錄每只小鼠的肝臟、脾臟和腸各段沉積蟲卵量，取均值分別計算各自的沉積蟲卵百分比，計算依照如下公式：

2 結(jié) 果

2.1 成蟲的計數(shù) BALB/c小鼠人工感染尾蚴42 d后，血吸蟲成蟲多在肝門處寄生，且多以雌雄合抱形式存在。其中在肝門附近的血管居多，在其他腸系膜血管均有寄生，且活體觀察發(fā)現(xiàn)血吸蟲在血管內(nèi)處于游走狀態(tài)，小鼠處死后不同部位相對寄生數(shù)見表1。

表1 不同部位血吸蟲成蟲數(shù)

2.2 蟲卵的計數(shù) 對不同臟器組織中的蟲卵進行計數(shù)，不同臟器組織中蟲卵的數(shù)目差別很大，見圖1。每g組織蟲卵數(shù)分別是肝(5.40±1.18)×104、脾(3.90±1.53)×103、小腸上段(1.77±0.48)×104、小腸中段(1.48±0.39)×104、小腸下段(1.45±0.41)×104、直腸(1.03±0.31)×105、盲結(jié)腸(6.65±2.63)×104。計算各組織中沉積蟲卵含量百分比，分別為肝臟(59.64%)、脾臟(0.81%)、整個腸腔(39.55%)，其中小腸上段(6.27%)、中段(5.24%)、下段(5.14%)、盲結(jié)腸(17.48%)、直腸(5.41%)，見圖2。經(jīng)統(tǒng)計分析結(jié)果表明：肝臟與脾臟、腸道相比；直腸與盲結(jié)腸相比；小腸上段與小腸中段、小腸下段相比，P<0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。在感染第42 d，脾臟所含蟲卵數(shù)最低，其次是小腸中段和小腸下段。

圖1 不同組織沉積蟲卵數(shù)

圖2 不同組織中沉積蟲卵百分比

2.3 蟲卵孵化率的比較 小鼠感染血吸蟲42 d后，定量取不同組織進行沉積蟲卵的毛蚴孵化實驗，結(jié)果見圖3。經(jīng)統(tǒng)計分析結(jié)果表明：肝臟與脾臟、腸道相比；直腸與盲結(jié)腸相比；小腸上段與小腸下段相比；小腸中段與小腸下段相比，P<0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。其中肝臟組織和盲結(jié)腸每g組織中能孵化的蟲卵數(shù)相對較多，而整個小腸各段的孵化數(shù)均較少。

圖3 不同組織孵化毛蚴數(shù)

由上述數(shù)據(jù)可以得出不同組織中沉積蟲卵孵化的毛蚴數(shù)是不同的，肝臟中的孵化率最高，而小腸中的孵化率最低，結(jié)果見表2。

表2 不同組織孵化率

2.4 各組織病理切片觀察 小鼠感染血吸蟲42 d后，剖殺可見肝臟失去鮮活的紅色呈現(xiàn)灰白色，表面密布白色和灰白色小點，肝臟質(zhì)地變硬失去彈性；脾臟變大；腸道破開后，亦可見有糜爛、潰瘍、點片狀出血，直腸部位有鋪路石樣改變并可見典型的灰黃色血吸蟲卵結(jié)節(jié)。

對各組織做病理切片檢查，如圖4所示。肝臟：可見大量慢性肉芽腫結(jié)節(jié)，蟲卵周圍有大量炎癥細胞分布，肝細胞有灶性壞死。脾臟：脾組織正常結(jié)構(gòu)存在，脾竇淤血，皮質(zhì)脾小體反應(yīng)性增大，有濾泡形成，偶見蟲卵。小腸上段：粘膜下層少量蟲卵肉芽腫形成，腸粘膜炎癥，粘膜上皮部分壞死脫落。小腸中段：粘膜下層小型蟲卵肉芽腫，散在分布，腸粘膜結(jié)構(gòu)多數(shù)尚好，粘膜上皮部分壞死脫落。小腸下段：粘膜下層數(shù)個小型蟲卵肉芽腫形成，腸粘膜炎癥，粘膜上皮部分壞死脫落。盲腸：粘膜下層大量蟲卵肉芽腫形成，腸粘膜炎癥，粘膜表淺上皮多灶性壞死脫落。結(jié)腸：粘膜下層少量急慢性蟲卵肉芽腫形成。腸粘膜炎癥細胞浸潤，部分表淺上皮壞死脫落。直腸：直腸粘膜下層大量急慢性蟲卵結(jié)節(jié)呈灶性分布。

注：A：肝臟、B：脾臟、C：小腸上段、D：小腸中段、E：小腸下段、F：盲腸、G：結(jié)腸、H：直腸。箭頭所指為蟲卵。

A: Liver; B: Spleen; C: The upper section of the small intestine; D: The middle section of the small intestine; E: The lower section of the small intestine; F: Cecum; G: Colon; H: Rectum. Arrows indicate the eggs.

圖4 各組織病理切片(HE染色)

Fig.4 Pathological slices of each tissue (Hematein Eosin)

3 討 論

血吸蟲發(fā)育階段中的尾蚴、童蟲及成蟲、蟲卵等均可引起病變，但以蟲卵引起的病變最嚴重，對機體的危害也最大[4]。通過研究宿主內(nèi)臟中血吸蟲沉積蟲卵的分布，有助于明確宿主的損傷部位和損傷程度。

一般認為，日本血吸蟲主要寄生在宿主的腸系膜上靜脈的前支和門靜脈，本實驗通過活體檢測發(fā)現(xiàn)，血吸蟲成蟲廣泛分布在感染小鼠的門靜脈和腸系膜上、中、下靜脈，且成蟲在上述血管中處于緩慢的移行過程，寄生部位并不固定。此外，比較寄生部位的成蟲數(shù)量與周圍組織沉積蟲卵數(shù)量，兩者之間并非一一對應(yīng)關(guān)系。

血吸蟲蟲卵主要沉積在肝臟與腸道。更精細的研究表明，感染42 d的BALB/c小鼠蟲卵的分布具有一定的特點，從肝、腸、脾3大器官的蟲卵分布看，蟲卵在脾臟的沉積數(shù)量最少，脾臟的病理損傷也較輕，可能是感染42 d，蟲卵造成的門靜脈分支栓塞，以及蟲卵肉芽腫引起的門靜脈周圍纖維組織增生，使肝內(nèi)門靜脈分支阻塞和受壓尚不嚴重，門靜脈高壓處于形成階段，脾的功能暫未受到嚴重影響?？梢酝茰y，隨著血吸蟲感染產(chǎn)生門脈高壓造成肝臟竇性充血以及纖維變性，部分蟲卵將轉(zhuǎn)而在小鼠脾臟中沉積。從腸道各段比較分析，在小腸的沉積蟲卵數(shù)較少，尤其是小腸的中段。小腸的上段的前端為十二指腸，為膽管開口部位，是否有進入肝臟的蟲卵經(jīng)此進入腸道值得進一步研究；相比較而言，盲結(jié)腸和直腸的蟲卵沉積最多，尤其是小鼠直腸部位，單位重量的直腸沉積蟲卵最多；蟲卵沉積數(shù)量和病理切片顯示的病理變化一致，沉積蟲卵數(shù)少的脾臟和小腸，病變較輕，反之，肝臟和直腸等部位沉積蟲卵多，病理損傷嚴重。早在1924 年，F(xiàn)aust和Meleney[5]在研究中就發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲感染后，病人結(jié)腸的病理損傷最嚴重。Vogel和Minning[6]使用日本血吸蟲中國大陸株感染恒河猴后，發(fā)現(xiàn)蟲卵肉芽腫引起的消化道的損傷主要在大腸部位。我們的檢查揭示小鼠感染42 d后，血吸蟲蟲卵在小腸的沉積數(shù)量并不多，形成的病理損傷也不是最重的，這同上述文獻一致。而有文獻報道[5]，在實驗感染的狗中，小腸的空腸卻是損傷最嚴重的部位。在日本，Ito[7]對日本血吸蟲感染的實驗兔和小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，蟲卵引起的損傷部位多數(shù)集中位于低位十二指腸和高位空腸，而腸道其他部位損傷少見。造成這一變化的原因可能在易感宿主體內(nèi)血吸蟲的數(shù)量和感染時間的不同，此外，日本血吸蟲蟲卵引起損傷的分布因地理株系與宿主品系的不同也會有所改變。

不同組織器官沉積蟲卵的孵化率也具有一定規(guī)律，感染42 d的小鼠，肝臟沉積蟲卵的孵化率相對最高，而小腸各段沉積蟲卵的孵化率均較低，小腸中的蟲卵多靠近肌層，發(fā)育還不成熟，導(dǎo)致小腸中的孵化率相對較低。在大腸中腸粘膜炎癥細胞浸潤，部分表淺上皮壞死脫落，且蟲卵更靠近粘膜層，易于脫落進入腸腔，且蟲卵大多發(fā)育成熟，孵化率相對于小腸較高。腸道沉積蟲卵逐步引起腸組織的病變、潰爛，這部分已發(fā)育一定時間的蟲卵率先進入腸道中隨糞便排出了體外，形成腸道沉積蟲卵孵化率相較肝臟沉積蟲卵的孵化率降低。

從80年代起，國內(nèi)學(xué)者開始研究日本血吸蟲病人糞便中蟲卵分布的特征，以期待對以糞樣檢測為主要手段的血吸蟲病診斷提供科學(xué)的解釋。余金明等[8]發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲卵在糞便中的分布具有聚集性。蟲卵主要分布在糞便的表層及頭端，從表面至內(nèi)部及從頭至尾部蟲卵數(shù)有逐漸減少的趨勢。我們研究發(fā)現(xiàn)小鼠的蟲卵主要沉積在盲結(jié)腸和直腸，這部分是糞樣成型的場所，處于盲結(jié)腸處的糞樣中水分等物質(zhì)被大腸吸收，大腸的蠕動已經(jīng)不可能充分混勻盲結(jié)腸處掉落的蟲卵，當(dāng)糞樣成型進入直腸后，直腸處排出的蟲卵只能粘附于糞樣表面，形成糞樣蟲卵的聚集分布和表層分布的特點。

本研究系統(tǒng)的檢測易感動物BALB/c小鼠定量人工感染血吸蟲后沉積蟲卵的分布情況以及蟲卵孵化率的不同，豐富了日本血吸蟲感染小鼠模型中蟲卵分布的研究，對排出蟲卵在糞樣中的分布也做了推理。值得注意的是，本論文截取感染42 d小鼠，研究蟲卵沉積情況以及蟲卵總量的分布，若血吸蟲感染數(shù)量的不同以及隨著血吸蟲病的進展，蟲卵的沉積可能將發(fā)生改變，值得今后做進一步研究。

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Zhu Chuan-gang, Email: zcg@shvri.ac.cn

Distribution ofSchistosomajaponicumeggs in each tissues of BALB/c mice

XU Rui1,ZHAO Deng-yun1,LIN Jiao-jiao1,LIU Jin-ming1,LU Ke1,HONG Yang1, LI Hao1,LIU Ying-chun1,LIU Yi-ping2,XU Yu-mei3,ZHU Chuan-gang1

(1.ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryforAnimalParasitology,MinistryofAgriculture,Shanghai200241,China; 2.AnhuiProvincialCenterforAnimalDiseaseControlandPrevention,Hefei230091,China; 3.DepartmentofClinicallaboratory,shanghaiXvhuiCentralHospital,Shanghai200031,China)

We investigated the distribution of eggs ofSchistosomajaponicumin each tissue, each BALB /c mice were infected withSchistosomajaponicummiracidium (40±1). At 42 days post infection, the mice's livers, spleens and intestines (the upper, middle and lower section of the small intestine, cecocolon, and rectums) were separated for counting the adult worms, eggs ofSchistosomajaponicum, hatching miracidias and for pathological examination. TheSchistosomajaponicumeggs had different distribution in the tissues of BALB/c mice. The percentage of eggs was 59.64% in liver, 0.81% in spleen, 6.27% in the upper of small intestine, 5.24% in the middle of small intestine, 5.14% in the lower of small intestine, 17.48% in cecocolon, and 5.41% in rectum. And the eggs in liver had a high hatching rate comparing with eggs in the other tissues (0.19%). HE staining showed that the inflammatory formation was around the lodges eggs in liver and the intestines emerged different degrees of necrosis. Liver of infected mice had the largest number of eggs per gram, followed by those in cecocolon, the least ones was in spleen. Furthermore, the pathogenesis was correlated with the deposition of eggs.

Schistosomajaponicum; BALB/c mice; different tissue; density of eggs

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項基金(No.200903036)，中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目(No.2014JB01)

朱傳剛， Email:zcg@shvri.ac.cn

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部寄生蟲學(xué)重點開放實驗室，國家防治動物血吸蟲病專業(yè)實驗室，上海 200241; 2.安徽省動物疫病預(yù)防與控制中心，合肥 230091; 3.上海徐匯區(qū)中心醫(yī)院檢驗科,上海 200031

Supported by the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interests (No. 200903036) and the Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund (No. 2014JB01)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.017

R383.2

A

1002-2694(2015)06-0574-05

2014-07-21；

2014-12-01