DNA條形碼技術(shù)在麻蠅亞科鑒定中的應(yīng)用

方義亮，張建慶，肖 武，高 博，房長(zhǎng)天，卞玘璠，徐保海

DNA條形碼技術(shù)在麻蠅亞科鑒定中的應(yīng)用

方義亮1，張建慶1，肖 武1，高 博1，房長(zhǎng)天1，卞玘璠2，徐保海3

目的 建立麻蠅亞科種類鑒定的DNA條形碼技術(shù)，以期解決麻蠅亞科雌性個(gè)體無法通過形態(tài)鑒定的問題。方法 通過對(duì)福建口岸截獲的黑尾黑麻蠅、黃須亞麻蠅、褐須亞麻蠅、棕尾別麻蠅、醬亞麻蠅等標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定，與BOLD上下載的88條麻蠅亞科蠅種序列進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算遺傳距離、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果 5份樣本擴(kuò)增獲得COI的長(zhǎng)度為658 bp，在線BLAST比對(duì)結(jié)果顯示相似度99%以上，遺傳距離計(jì)算結(jié)果顯示種內(nèi)差異0～0.015 4，種間差異0.024 9～0.153 8，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示麻蠅亞科同種能聚在一塊，Bootstrap值為1 000。結(jié)論 DNA條形碼技術(shù)可以作為麻蠅亞科蠅種鑒定在形態(tài)學(xué)鑒定之外的重要方法補(bǔ)充。

DNA條形碼；COI;蠅類鑒定

麻蠅科是國(guó)境口岸醫(yī)學(xué)蠅類監(jiān)測(cè)的重要部分，種類繁多，全世界已知共有2 500余種，在我國(guó)也有312種[1](2003年)。麻蠅亞科系我國(guó)麻蠅科中最重要的亞科，種類也最多，與人類關(guān)系密切。麻蠅亞科的外部共同特征有：后足基節(jié)在上部后表面有細(xì)的柔毛群，有時(shí)這些毛很少是短毛或裸；腹部底色黑，無界限分明的斑，而具黑白方塊相間的斑紋，即棋盤狀斑。麻蠅亞科多數(shù)種類形態(tài)比較接近，形態(tài)鑒定主要依據(jù)雄蟲尾器，而雌蟲鑒定比較困難，另外若截獲的標(biāo)本殘缺不全，形態(tài)鑒定便無法進(jìn)行。DNA條形碼技術(shù)(DNA Barcoding)是利用目的DNA片段序列區(qū)分生物物種的一種全新方法，近幾年得到了快速的發(fā)展，因其能不受發(fā)育狀態(tài)、性別、形態(tài)完整性影響，在昆蟲鑒定方面得到廣泛的應(yīng)用[2]，本文通過DNA條形碼技術(shù)對(duì)福建口岸常見的麻蠅亞科蠅種進(jìn)行鑒定，以期在國(guó)境口岸醫(yī)學(xué)媒介生物鑒定中，作為形態(tài)學(xué)鑒定之外的重要方法補(bǔ)充。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)物樣本來源 ①黑尾黑麻蠅(Helicophagellamelanura)②黃須亞麻蠅(Parasarcophagamisera)③褐須亞麻蠅(Parasarcophagasericea)④棕尾別麻蠅(Boettcheriscaperegrina)⑤醬亞麻蠅(Parasarcophagadux)均由福建口岸采集或者截獲標(biāo)本。

1.1.2 虛擬樣本來源 虛擬樣本來自BOLD數(shù)據(jù)庫(http://boldsystems.org/)，檢索關(guān)鍵詞Sarcophaginae(麻蠅亞科),以引物與本研究相同為條件，經(jīng)篩選共得37個(gè)蠅種88條記錄，詳細(xì)見表1。

1.1.3 主要試劑和引物 昆蟲基因組提取試劑盒,ExTaq、25 mmol/L MgCl2、10×buffer、2.5 mmol/L dNTP購自寶生物工程(大連)有限公司,PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物，見表2。

表1 BOLD檢索數(shù)據(jù)匯總表

表2 引物

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)鑒定 麻蠅亞科雄性蠅通過拉出尾器并固定，結(jié)合其他體表特征，參見相關(guān)書籍檢索表[1]進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.2.2 蠅蟲基因組提取 取蠅蟲單只蠅足清洗后，通過昆蟲基因組提取試劑盒進(jìn)行蠅蟲基因組提取。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物電泳 擴(kuò)增體系25 μL，其中Taq酶 0.125 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，10×ExTaqBuffer 2.5 μL ，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，上下引物各 0.5 μL，雙蒸水15.875 μL，DNA模版1.5 μL，并按以下條件進(jìn)行反應(yīng)：94 ℃ 3 min預(yù)變性；94 ℃ 30 s 變性，50 ℃ 30 s退火，72 ℃ 45 s 延伸，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min后延伸。

擴(kuò)增后的產(chǎn)物加樣置于電泳槽直流電壓130 V，30 min進(jìn)行電泳。電泳后置于凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.4 序列測(cè)定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化，并用四色熒光標(biāo)記雙脫氧鏈終止法測(cè)序(AB公司DNA測(cè)序儀3730 生工生物工程公司(上海)有限公司)，測(cè)序的引物為PCR擴(kuò)增引物，正反鏈雙向測(cè)序以保證序列的準(zhǔn)確性。

1.2.5 序列分析 1)用CodonCode軟件查看測(cè)序獲得的序列，去除低質(zhì)量的末端序列與引物序列，并進(jìn)行序列組裝，將組裝完成的序列保存為.fasta格式。2)在NCBI(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行在線BLAST對(duì)比。3)將上述所獲得的8組序列片段進(jìn)行對(duì)比(ClustalW)，之后進(jìn)行遺傳距離計(jì)算并構(gòu)建NJ樹(Neighbor-joining Tree)，參數(shù)選擇為Kimura雙參數(shù)距離(K2P)模式，Bootstrap值為1 000。

2 結(jié) 果

2.1 蠅種基因組提取及測(cè)序結(jié)果 本次實(shí)驗(yàn)共提取出8個(gè)蠅種的DNA。片段核苷酸長(zhǎng)度在750 bp左右，經(jīng)過分析軟件去除雜帶和引物后，剩下的核苷酸片段長(zhǎng)度為658 bp。

2.2 在線BLAST結(jié)果 見表3。其結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)樣品與GenBank已知序列相似度較高(>99%)，與形態(tài)鑒定結(jié)果相符合。③號(hào)樣本與BLAST比對(duì)結(jié)果不一致，但實(shí)為同種異名[4]。

表3 不同蠅種在線BLAST比對(duì)結(jié)果

2.3 序列分析與遺傳距離 本研究中麻蠅亞科蠅種共計(jì)39種92個(gè)體的堿基平均組成為：A=29.61%,T=36.89%,C=17.30%,G=16.20%,A+T=66.5%，具有明顯的A+T傾向性。

經(jīng)過計(jì)算麻蠅亞科92個(gè)不同個(gè)體的不同蠅種的遺傳距離獲得麻蠅亞科不同蠅種種間差異0.0 249～0.1 538，種內(nèi)差異0～0.0 154(<2%)(如圖1所示)，種間差異和種內(nèi)差異沒有交叉，表明COI(658 bp)序列能較好地對(duì)麻蠅亞科的不同種類進(jìn)行鑒別，種內(nèi)差異小于2%即可判斷為同一種。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 如圖2所示，麻蠅亞科中同一種能夠較好地歸為一類，同時(shí)Bootstrap值都在99以上。本實(shí)驗(yàn)中的實(shí)物標(biāo)本黃須亞麻蠅同AUSFF264-11，AUSFF268-11，AUSFF250-11聚一類，Bootstrap值為100； 褐須亞麻蠅同AUSFF319-11，AUSFF295-11，AUSFF313-11聚一類，Bootstrap值為100；棕尾別麻蠅同AUSFF082-08聚一類，Bootstrap值為100；醬亞麻蠅同AUSFF229-11，AUSFF228-11，AUSFF235-11聚一類，Bootstrap值為100，以上鑒定結(jié)果都同形態(tài)鑒定相符合。

圖1 麻蠅亞科不同蠅種種間差異和種內(nèi)差異

Fig.1 Interspecific and intraspecific difference of different Sarcophaginae species

3 討 論

DNA條形碼技術(shù)于2003年由Hebert[5]等提出來以后，因其有不受物種發(fā)育階段的影響、不受物種個(gè)體特征的影響、不受物種的限制、可以鑒定出許多群體中普遍存在的隱存分類單元、獲取信息量大、精確性高、操作方法簡(jiǎn)便、高效且易掌握等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)媒介生物的鑒定。Cywinska等[6]對(duì)加拿大的37種蚊類進(jìn)行研究，結(jié)果表明，屬間差異比種間差異高近20倍，屬間差異平均為10.4%，種間差異平均0.5%。張映梅等[7]對(duì)我國(guó)44種重要蚤類進(jìn)行DNA條形碼初步研究，結(jié)果表明，同種個(gè)體之間的同源性達(dá)到99%以上，不同種之間的同源性最高僅為90%，且?guī)缀跛性轭惗寄鼙籇NA條形碼正確鑒定。孫毅等[8]對(duì)中國(guó)硬蜱科30種重要種類進(jìn)行了研究，結(jié)果表明COI基因核苷酸序列的種內(nèi)差異小于3%，種間差異大于25%，且沒有種間交叉，對(duì)已測(cè)定的30種蜱鑒定正確率可達(dá)到100%。本研究遺傳距離計(jì)算結(jié)果顯示種內(nèi)差異0～0.0 154(<2%)，種間差異0.0 249～0.1 538，種內(nèi)差異小于種間差異，種內(nèi)差異與種間差異無交叉，結(jié)論與上述研究是一致。

從目前眾多的DNA條形碼技術(shù)研究來看，DNA條形碼技術(shù)在生物鑒定方面具有技術(shù)可行性，很適合應(yīng)用于形態(tài)學(xué)無法鑒定，或者對(duì)未知種類的鑒定，但就目前技術(shù)成本來看，DNA條形碼技術(shù)所需的實(shí)驗(yàn)成本較高，不太適合于平時(shí)高通量的醫(yī)學(xué)媒介生物鑒定，另外因?yàn)樵摷夹g(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)器材和實(shí)驗(yàn)人才的實(shí)驗(yàn)水平有一定的要求，不太適合在口岸一線做大面積推廣，最后,該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用很大程度依賴于DNA條形碼庫的構(gòu)建和擴(kuò)充，而雖然目前國(guó)內(nèi)外都致力于開發(fā)DNA條形碼庫，但仍存在庫中的生物條形碼有些種類欠缺的情況?？傊?，DNA條形碼技術(shù)作為新興的技術(shù)，目前在口岸醫(yī)學(xué)媒介生物鑒定中可作為傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法的重要補(bǔ)充，但其發(fā)展和成熟有賴于技術(shù)進(jìn)一步規(guī)范和統(tǒng)一，同時(shí)需要條形碼庫的進(jìn)一步完善和補(bǔ)充。

圖2 92種麻蠅亞科不同蠅種COI基因序列(658bp)NJ(鄰接法)樹

Fig.2 NJ (neighbor-joining) tree of 92 Sarcophaginae species based on COI gene fragment (658 bp)

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Sarcophaginae identification by DNA-barcoding

FANG Yi-liang1,ZHANG Jian-qing1,XIAO Wu1,GAO Bo1,FANG Chang-tian1,BIAN Qi-fan2,XU Bao-hai3

(1.FujianInternationalTravelHealthcareCenter,Fuzhou350001,China; 2.FujianMedicalUniversity,Fuzhou350004,China; 3.FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China)

In this study, we aimed to establish method for identifying Sarcophaginae by DNA-barcoding and to solve the problem that Sarcophaginae female species could not be identified by morphology. We amplified and analyzed the sequences of these samples in Fujian frontier such asHelicophagellamelanura,Parasarcophagamisera,Parasarcophagasericea,Boettcheriscaperegrine,Parasarcophagabrevicornis,Parasarcophagadux,Parasarcophagasimilis,Parasarcophagaalbiceps,ParasarcophagaPingi, andSeniorwhiteareciproca. Secondly, we aligned these sequences with 88 Sarcophaginae species loaded from BOLD. Thirdly, we estimated the genetic distances and built system evolutionary tree. The result of amplification with 5 samples showed that length of the obtained COI sequences were 658 bp. And the result of alignment on BOLD line showed that index of similarity of the same species was above 99%. The result of calculation genetic distances showed that intraspecific difference was 0-0.015 4 and interspecific difference was 0.024 9-0.153 8. Phylogenetic tree showed that the same Sarcophaginae species stayed together on value of Bootstrap 1000. It came to a conclusion that DNA-barcoding can be the important method to supplement of morphologically identifying Sarcophaginae.

DNA-barcoding; COI; identifying flies

1.福建國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，福州 350001； 2.福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,福州 350001 3.福建省疾病預(yù)防控制中心,福州 350001 Email: anew627@163.com

Supported by the Science and Technology Plan of Fujian Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau of P.R.C (No. FK2012-12)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.016

R384.2

A

1002-2694(2015)06-0569-05

2014-08-19；

2014-12-24

福建檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目基金(No.FK2012-12)