Treg/Th17失衡與ITP的發(fā)生相關(guān)性研究

摘要：目的 通過醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)探究Treg/Th17失衡與ITP的關(guān)系。方法 選取2010年1月～2012年2月在我院進(jìn)行治療的ITP患者28例作為實(shí)驗(yàn)組，再另選在我院進(jìn)行體檢的健康者28例作為對照組，均用流式細(xì)胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組外周血中的Treg比例較對照組低，Th17百分率較對照組高，血漿IL-17水平兩組差異不大。結(jié)論 研究表明，Treg與Th17所占細(xì)胞的百分率失衡與ITP的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，并且可能研究出新治療方法。

關(guān)鍵詞：Treg；Th17；失衡；ITP；流式細(xì)胞術(shù)

ITP即特發(fā)性血小板減少性紫癜，是一種原因不明的獲得性出血性疾病，主要特征為血小板減少，骨髓巨核細(xì)胞正?；蛟龆啵g期的女性易發(fā)病[1]，Treg即調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，是控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的細(xì)胞群，具有免疫功能，Th17是輔助性T細(xì)胞，具有機(jī)體防御和自身免疫作用，詳細(xì)研究情況如下。

1資料與方法

1.1一般資料[2] 選取自2010年1月～2012年2月在中醫(yī)院進(jìn)行治療的ITP患者和身體健康的人各28例作為研究對象，實(shí)驗(yàn)組中男性患者9例，女性患者19例，年齡在20～62歲，取患者治療前后和對照組的外周血，用流式細(xì)胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附法分別檢測兩種細(xì)胞和IL17含量。

1.2使用儀器及試劑 主要試劑有固定破膜劑，異硫氰酸熒光素標(biāo)記即FITC標(biāo)記，標(biāo)記抗人CD3單克隆抗體和抗人CD4單克隆抗體，用藻紅蛋白青色素5.1即PC5標(biāo)記抗人CD4單克隆抗體和CD25單克隆抗體，用藻紅蛋白即PE標(biāo)記抗人IL-17單克隆抗體、抗人IFN-γ單克隆抗體和抗人FoxP3單克隆抗體；主要儀器有流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀、流式上樣管、混勻振蕩器、離心機(jī)、移液器。

1.3實(shí)驗(yàn)操作步驟

1.3.1收集血液標(biāo)本 本次實(shí)驗(yàn)使用靜脈采血法，選取肘部靜脈，并叮囑其采血當(dāng)天清晨空腹，抽血后存放與月肝素抗凝管中，盡早使用，否則會影響實(shí)驗(yàn)。

1.3.2檢測Treg 采用FOXP3流式檢測方法，用兩個流式上樣管，分別標(biāo)記好后加入100ul準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)約為1*106個；按照1.2中所述細(xì)胞表面抗原染色對表面抗原進(jìn)行標(biāo)記；用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞；漩渦震蕩重懸細(xì)胞后加入1ml的固定破膜劑，進(jìn)行漩渦混勻；避光孵育30min；加入2mlPermeabilization Buffer工作液離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液。再次對細(xì)胞進(jìn)行避光孵育，并洗滌；加入稀釋好的2%正常大鼠血清100ul，避光4℃孵育15min；封閉液不需要洗去，直接加入稀釋好的熒光標(biāo)記FOXP3抗體20ul，避光4℃孵育30min，加入2mlPermeabilization Buffer工作液離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液；重復(fù)上一步；用適量體積的Flow Cytometry Stainning Buffer重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。

1.3.3檢測Th17 采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，將血液首先進(jìn)行梯度離心得到外周血單個核細(xì)胞即PBMC，按照1.2所示染色對應(yīng)方法對細(xì)胞進(jìn)行染色，將兩組患者的細(xì)胞均接種到培養(yǎng)板上，加入佛波酯25ng/ml，離子霉素和莫能霉素各1μg/ml，然后再36℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，6h后取出，并將其稀釋，將細(xì)胞懸液100μl分別加到兩支試管中，加入CD4單克隆抗體，放入混勻振蕩器中進(jìn)行混勻，避光在室內(nèi)存放20min，拿出試管，用磷酸鹽溶液洗滌兩次，再加入固定破膜劑進(jìn)行固定，20min后放入離心機(jī)中離心，并棄去上清液，再用磷酸鹽溶液進(jìn)行洗滌2次，加入固定破膜劑后對細(xì)胞打孔，再放入離心機(jī)中離心，棄去上清液，實(shí)驗(yàn)組加入藻紅蛋白，對照組中加入IgG1-PE10μl，最后再用磷酸鹽溶液洗滌2次，放入流式細(xì)胞儀中檢測。

1.3.4 IL-17的檢測 兩組患者均使用人白介素17檢測試劑盒。

1.4診斷標(biāo)準(zhǔn) 記錄比較兩組人員體內(nèi)含有的Treg和Th17的比例大小，進(jìn)行研究。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以上實(shí)驗(yàn)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel進(jìn)行統(tǒng)一運(yùn)算，計(jì)量資料用T進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用χ2 進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1患者治療結(jié)果 初次治療患者在經(jīng)過治療后Treg細(xì)胞數(shù)量含量增高，但相對正常人的Treg細(xì)胞數(shù)量仍然較低，ITP晚期患者較難治，見表1。

2.2通過比較，實(shí)驗(yàn)組Treg細(xì)胞所占比例較低，Th17細(xì)胞較高，Treg/Th17的值較對照組有所降低，見表2。

3討論

3.1 Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞 Treg細(xì)胞是一類近期被人們認(rèn)識發(fā)現(xiàn)的，起源于胸腺，發(fā)揮抑制性免疫調(diào)節(jié)作用，持續(xù)性表達(dá)IL-2Rα鏈，具有免疫抑制性和免疫無能性兩大特征，在自身免疫性疾病治療，腫瘤的免疫治療以及抑制耐受的誘導(dǎo)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，Treg細(xì)胞常用的分子標(biāo)記有CD25，CD4，這兩種物質(zhì)可用來鑒定Treg細(xì)胞，但隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)這種鑒別方法并不準(zhǔn)確，在CD4和CD25的基礎(chǔ)上加入CD127聯(lián)合使用可得到高純度的Treg細(xì)胞，通過CD4，CD25的含量可鑒定患者所患病的治療程度，Th細(xì)胞可分泌IL-17，是由TH0細(xì)胞在IL6和IL23的刺激下分化而成的輔助性T細(xì)胞，對抗細(xì)胞外細(xì)菌及霉菌，經(jīng)上述醫(yī)學(xué)研究可發(fā)現(xiàn)，ITP患者所含的Th17細(xì)胞較常人高。

3.2 Treg/Th17與ITP的關(guān)系 兩種細(xì)胞在分化關(guān)系上緊密相關(guān)，IL6會抑制調(diào)節(jié)性細(xì)胞的分化，促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化，CD4+CD25+Treg細(xì)胞通過活化T細(xì)胞的CTLA-4，抑制活化T細(xì)胞的免疫功能，Tr1分泌IL-10抑制T細(xì)胞的增殖分化，Th3分泌TGF-β抑制效應(yīng)細(xì)胞增殖和分化，同時(shí)抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生以降低其免疫功能。Treg/Th17發(fā)生變化會引起身體各項(xiàng)機(jī)能的紊亂，可能會導(dǎo)致ITP的發(fā)生。

綜上所述，Treg/Th17失衡是導(dǎo)致ITP的可能原因，為了保證結(jié)果的可靠性，采集患者標(biāo)本前要使患者了解此方面的知識，使其采血時(shí)不會過于緊張，調(diào)節(jié)Treg/Th17失衡可用來治療ITP，是一種新型治療方法，有很好的應(yīng)用前景，但目前ITP的具體病因和治療方法還不完善，因此這兩種細(xì)胞失衡對ITP的具體作用還不明確，對ITP的具體治療方法還需要進(jìn)一步探究。

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編輯/許言