抵抗素對人臍靜脈內(nèi)皮細胞纖溶系統(tǒng)活性的影響

摘要：目的 探討抵抗素對血管內(nèi)皮細胞組織型纖溶酶原激活物（t-PA）及其抑制物（PAI-1）表達的影響。方法 人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）3～4代分為單純培養(yǎng)基對照組、不同濃度抵抗素（Resistin，RE）（25、50、100ng/ml）組，培養(yǎng)6、24、48h后，ELISA法測各組上清液中t-PA和總PAI-1蛋白含量。結(jié)果 不同濃度抵抗素（25，50，100ng/ml）作用24、48h可下調(diào)HUVECs上清液中t-Pa蛋白含量，上調(diào)PAI-1蛋白含量（P<0.05）。結(jié)論 高濃度抵抗素可通過影響t-PA，PAI-1的表達促進血栓形成。

關(guān)鍵詞：抵抗素； 組織型纖溶酶原激活物；纖溶酶原激活物抑制物-1

Effects of Resistin on the Fibrinolysis Activity of HUVEC

LIU Dan1，JIN Hong2

（1.Department of Cardiovascular Medicine，Jiaxing First Hospital，Jiaxing 314000，Zhejiang，China；2.Department of Cardiovascular Medicine，The First Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University，Shantou 515041，Guangdong，China）

Abstract：Objective To investigate the effect of resistin at different concentrations on the expressions of fibrinolytic factor tissue plasminogen aetivator（t-PA） and plasminogen activator inhibitor-1（PAI-1） in Human Umbilical Vein Endothelial Cells （HUVECs）.Methods HUVECs within 3～4 passages were incubated with different concentrations resistin（0，25，50，100ng/ml） for 6，24，48h respectively. Levels of t-PA and PAI-1 antigen in the supernatant were assayed with ELISA kits. Results t-PA protein level increased， while PAI-1 protein level decreased significantly after resistin（25，50，100ng/ml） treated for 24～48h （P<0.05）. Conclution High levels of resistin may accelerate thrombosis development by inhibiting fibrinolytic activity by virtue of its effects on t-PA and PAI-1expression.

Key words：Resistin； Tissue plasminogen activator（t-PA）； Plasminogen activator inhibitor-1（PAI-1）

抵抗素作為新近發(fā)現(xiàn)的一種脂肪細胞因子，在心血管疾病特別是血栓性心血管疾病中的作用成為近年來研究的熱點。高濃度抵抗素是冠心病、急性冠脈綜合征的一個危險因素[1-2]。血管內(nèi)皮的功能在血栓形成中起著重要作用， 組織型纖溶酶原激活物（t-PA）與纖溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）是主要由血管內(nèi)皮細胞分泌的人體內(nèi)重要調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)活性物質(zhì)，其活性決定了人體內(nèi)血栓不斷形成與不斷溶解之間的動態(tài)平衡，是評價血管內(nèi)皮功能的一個重要指標， 也是影響局部血栓形成的重要因素。本研究旨在觀察抵抗素 （Resistin，RE）對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）t-PA 及PA I-1表達的影響，從而揭示血栓性疾病的一個新的發(fā)病機制。

1資料和方法

1.1 一般資料 原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs），內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，生長因子，抗生素，多聚賴氨酸，胰酶，胰酶抑制劑，（美國Sciencell公司）；重組人抵抗素：（美國Peprotech公司）；Total t-PA ELISA Kit，Total PAI-1 ELISA Kit：上海太陽生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) HUVECs細胞在含5%胎牛血清的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中復蘇后于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每3～5d傳代1次，所用細胞為3～4代。

1.2.2細胞分組及干預 HUVECs傳代培養(yǎng)至第3代，待細胞生長達80%融合時消化接種至3塊96孔板，分別標記為板1，板2，板3.（接種密度1×105/ml，每孔100μL），24h后換成無血清及生長因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)6h，使各組細胞生長同步化，每塊96孔板細胞均隨機分為4組：無藥物對照組（control組），抵抗素25ng/ml組（Re25組），抵抗素50ng/ml組（Re50組），抵抗素100ng/ml組（Re100組）。以25ng/ml， 50ng/ml，100ng/ml抵抗素孵育細胞相應(yīng)時間；（板1為6h，板2為24h，板3為48h）。

1.2.3 t-PA、PAI-1蛋白水平檢測 吸取上清液，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定各組t-PA，PAI-1的蛋白含量（每組4個附孔）。

1.3統(tǒng)計 結(jié)果經(jīng)SPSS13.0軟件處理，數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差析，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 抵抗素對HUVECs上清液t-PA蛋白水平的影響 以25，50，100ng/ml抵抗素分別作用6，24，48h，與對照組相比，不同濃度抵抗素作用6h，t-PA蛋白水平無明顯變化；作用24h，t-PA蛋白水平均明顯下降（P<0.05），各濃度抵抗素處理組的t-PA蛋白水平無顯著差異；作用48h，t-PA蛋白水平明顯下降（P<0，01），50ng/ml抵抗素處理組較25ng/ml抵抗素處理組t-PA蛋白水平下降更為顯著（P<0.05）。（見圖1）

2.2抵抗素對HUVECs上清液PAI-1蛋白水平的影響 以25，50，100ng/ml抵抗素分別作用6，24，48h，與對照組相比，不同濃度抵抗素作用6h，PAI-1蛋白水平無明顯變化；作用24h，PAI-1蛋白水平均明顯上升， （P<0.05或P<0.01），各濃度抵抗素作用組PAI-1蛋白水平無顯著差異；作用48h，PAI-1蛋白水平明顯上升（P<0，01）； 50ng/ml及100ng/ml抵抗素處理組較25ng/ml抵抗素處理組PAI-1蛋白水平上升更為顯著（P<0.05）。（見圖2）

3討論

抵抗素是2001年新發(fā)現(xiàn)的一種由脂肪細胞分泌的肽類激素，在正常人體內(nèi)，抵抗素生理濃度為15ng/ml左右，而在糖尿病患者體內(nèi)，其血清濃度達到40ng/ml左右。[3-4]近來許多研究也發(fā)現(xiàn)，高濃度抵抗素可能是導致心血管疾病的危險因素，特別是在血栓性疾?。ü跔顒用}粥樣硬化性心臟病、心肌梗死、腦動脈血栓形成、深靜脈血栓形成）的發(fā)生發(fā)展中起著促進作用[5]。t-PA和PAI-1是由血管內(nèi)皮分泌的最重要的纖溶活性調(diào)節(jié)因子，其含量及活性失調(diào)，將使血管內(nèi)皮由抑制凝血向促進血栓形成轉(zhuǎn)變。臨床研究發(fā)現(xiàn)，MS及腦梗死患者血清中RE水平與t-PA負相關(guān)，而與PAI-1正相關(guān)[6]，提示人高RE水平可能會引起纖維溶解系統(tǒng)活性普遍降低，從而促進纖維蛋白形成，加快血栓形成。但抵抗素對于纖溶系統(tǒng)影響的基礎(chǔ)研究甚少。本實驗依據(jù)文獻報道[7]，在細胞水平，選用不影響細胞增殖的25～100ng/ml抵抗素作為干預因素，觀察其對血管內(nèi)皮細胞纖溶活性因素的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度抵抗素作用24h和48h后，細胞上清液PAI-1蛋白水平升高，t-PA蛋白水平下降， Jung HS[7]等用0～100ng/ml抵抗素作用于HUVECs，發(fā)現(xiàn)24h后，50、100ng/ml抵抗素作用組PAI-1mRNA及蛋白水較對照組明顯升高，我們的結(jié)果與其一致。而抵抗素在體外對t-PA的影響尚未搜索到相關(guān)文獻。本實驗同時檢測了抵抗素作用后t-PA、PAI-1這一對纖溶活性調(diào)節(jié)因子蛋白水平的變化，發(fā)現(xiàn)抵抗素下調(diào)HUVECs t-PA、上調(diào)PAI-1的表達基本呈濃度及時間依賴性，而100ng/ml抵抗素與50ng/ml抵抗素使t-PA及PAI-1蛋白的表達無顯著差異，可能是由于高濃度抵抗素雖未造成細胞凋亡或壞死，卻使內(nèi)皮細胞正常合成、分泌生物活性物質(zhì)的能力受到影響所致。抵抗素使血管內(nèi)皮細胞t-PA，PAI-1蛋白表達改變，導致纖溶活性受損，這可能是血漿高水平抵抗素與血栓性疾病的發(fā)生密切相關(guān)的原因之一。然而，本實驗僅對抵抗素作用后HUVECst-PA，PAI-1蛋白含量的影響作了初步探討，t-PA，PAI-1的基因表達的變化及其可能的細胞內(nèi)信號通路尚未闡明，Maengjo Kim等發(fā)現(xiàn)，在新生鼠的心室肌細胞中，高濃度的抵抗素可以激活ERK和p38MAPK[41]。NorataGD等報道，氧化型HDL-3可以經(jīng)P38MAPK信號通路促進內(nèi)皮細胞表達PAI-1[27]，鑒于抵抗素可在多種細胞中激活MAPK信號通路，而MAPK的活化可促進PAI-1的合成，推測MAPK信號通路有可能參與了抵抗素對HUVECs t-PA，PAI-1表達的調(diào)節(jié)。這有待進一步實驗觀察，以進一步闡明抵抗素對纖溶系統(tǒng)影響的具體機制，從而未血栓性心血管疾病的防治提供新的思路及理論依據(jù)。

參考文獻：

[1] Frankel DS， Vasan RS， D'Agostino RB Sr， et al. Resistin， adiponectin， and risk of heart failure the framingham offspring study[J].Am Coll Cardiol，2009，53（9）：754-762.

[2]Osawa H， Doi Y， Makino H， et al. Diabetes and hypertension markedly increased the risk of ischemic stroke associated with high serum resistin concentration in a general Japanese population： the Hisayama Study[J].Cardiovasc Diabetol，2009，8：60.

[3]Stejskal D， Proskova J， Adamovska S，et al.Preliminary experience with resistin assessment in common population[J].Biomed Pap Med Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2002，146：47.

[4]Fehmann HC，Heyn J.Plasma resistin levels in patients with type1 and type2 diabetes mellitus and healthy controls[J].Horm Metab Tes，2002，34：671-673.

[5]王劍，吳媛.急性冠脈綜合征患者血清抵抗素和超敏C反應(yīng)蛋白水平及臨床意義[J]實用臨床醫(yī)藥雜志， 2014， 18（16）：156-158.

[6]Fang W，Zhang Q， et a1.Resistin level is positively correlated with thrombotic complications in southem Chinese metabolic syndrome patients[J]. Endocrinol Invest，2011，34（2）：36-42.

[7]Wang J， Ruotsalainen S， Moilanen L， Lepist？ P，et al. The metabolic syndrome predicts cardiovascular mortality： a 13-year follow-up study in elderly non-diabetic Finns[J].Eur Heart，2007，28（7）：857-864.

[8]Maengjo K， Jae KO， Susumu S.et al. Role of resistin in cardic contractility and hypertrophy[J].Molecular and Cellular Cardiology，2008，45：270-280.

[9]Norata GD， Banfi C， Pirillo A， et.al Oxidised-HDL3 induces the expression of PAI-1 in human endothelial cells. Role of p38MAPK activation and mRNA stabilization[J].Haematol， 2004，127（1）：97-104.編輯/康潔