冠心病患者中Th17細(xì)胞水平的變化及其意義探討

摘要：目的 探討不同類型冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者外周血輔助性T細(xì)胞17（T help cell 17，Th17細(xì)胞）的變化及其臨床意義。方法 選取急性心肌梗死（AMI）患者20例、不穩(wěn)定性心絞痛（UA）患者25例、穩(wěn)定性心絞痛（SA）患者19例及健康體檢者22例。采用流式細(xì)胞儀檢測各組患者外周血Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例，采用實(shí)時定量PCR方法檢測IL-17mRNA的表達(dá)，采用酶聯(lián)免疫吸附方法（ ELISA）檢測各組患者外周血白細(xì)胞介素（IL）-17的表達(dá)。結(jié)果 AMI組和UA組患者外周血Th17細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞、IL-17mRNA、IL-17表達(dá)明顯高于SA組和健康對照組（P<0.001）；SA組和健康對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 AMI患者和UA患者外周血中Th17細(xì)胞比例增加， IL-17mRNA及IL-17水平升高， Th17 細(xì)胞可能參與動脈粥樣斑塊不穩(wěn)定和冠心病的發(fā)病。

關(guān)鍵詞：冠狀動脈粥樣硬化性心臟??；輔助性T細(xì)胞17；IL-17；IL-17mRNA

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（簡稱冠心?。┦枪跔顒用}血管發(fā)生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病，基本病因是冠狀動脈粥樣硬化。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是動脈血管壁的慢性炎癥反應(yīng)，其中CD4+T淋巴細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用[1]。近年來發(fā)現(xiàn)一種新的CD4+T淋巴細(xì)胞即Th17細(xì)胞，能分泌白介素（Interleukin）-17等多種細(xì)胞因子參與炎癥過程[2]。許多研究表明Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種疾病發(fā)病及進(jìn)展[3-4]。而目前動物實(shí)驗(yàn)表明， 在動脈粥樣斑塊的發(fā)生發(fā)展中， IL-17參與巨噬細(xì)胞的活化并通過相關(guān)機(jī)制釋放蛋白水解因子，IL-17和TNF-α水平的增加能夠發(fā)揮協(xié)同作用創(chuàng)造促炎微環(huán)境， 從而促進(jìn)動脈粥樣硬化性疾病的發(fā)生發(fā)展。由此我們推測 Th17細(xì)胞可能通過IL-17的促炎效應(yīng)，參與并促進(jìn)粥樣斑塊不穩(wěn)定和急性冠狀動脈綜合征（ACS）的發(fā)生發(fā)展。本研究通過檢測不同類型的冠心病患者外周血Th17細(xì)胞、細(xì)胞因子IL-17及IL-17mRNA表達(dá)水平，分別從細(xì)胞水平、分子水平及基因水平進(jìn)一步探討Th17細(xì)胞在冠心病中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2008年10月～2012年10月我院確診急性心肌梗死（AMI）患者20例，男17例，女3例，年齡（56.8±6.4）歲；不穩(wěn)定型心絞痛（UA）患者25例，男20例，女5例，年齡（52.9±5.9）歲；穩(wěn)定型心絞痛（SA）患者19例，男15例，女4例，年齡（55.6±7.2）歲。所有患者均行冠狀動脈造影檢查。對照組為同期經(jīng)冠脈造影及臨床癥狀排除冠心病的住院患者22例，男19例，女3例，年齡（53.5±6.8）。排除標(biāo)準(zhǔn)：6個月以內(nèi)的心肌梗死患者，并發(fā)腦卒中、嚴(yán)重的肝腎功能不全者，周圍血管疾病或周圍血管栓塞性疾病患者，惡性腫瘤患者，自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病及服用免疫抑制劑患者。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集 所有受試者及正常對照組在清晨空腹抽取外周靜脈血5ml置于肝素抗凝管中，標(biāo)本室溫狀態(tài)下1000轉(zhuǎn)離心15min，收集上清。分裝后-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2人外周血單個核細(xì)胞分離及Th17細(xì)胞檢測 清晨空腹采肘靜脈血5ml，肝素鈉抗凝， 用PBS等量稀釋后采用人淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法獲取外周血單個核細(xì)胞（PBMC）。用RPMI MEDIUM 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml。取出2×106個細(xì)胞，分別加入24孔無菌培養(yǎng)板的2個孔內(nèi)，每孔1×106個細(xì)胞，用RPMI MEDIUM 1640完全培養(yǎng)液定容至1L，每孔各加入2μl PMA（30ng/ml）和10μl Iono（750μg/ml），槍頭攪拌混勻，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱孵育1h，每孔再各加入1μl高爾基體阻斷劑；放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱孵育4～6h；收集細(xì)胞平均分為測定管和同型對照管。加入APC標(biāo)記的CD4（ebioscience公司）3μl，放入4°冰箱30min。FACS液體2ml洗兩遍。加入FIXATION/Permeabilization商品盒（BD公司）250μl，放入4°冰箱30min。加入Permeabilization Buffer液體1ml，1500轉(zhuǎn)/min，8min，離心倒去上清液，洗2遍。分別加入PE標(biāo)記的IL-17（ebioSCIENCE公司）和同型對照抗體10μl，放入4°冰箱30min。再用Buffer液洗3遍。倒去上清液后加入含1%的PFA固定。流式細(xì)胞儀測定Th17細(xì)胞比例。

1.2.3實(shí)時定量PCR檢測IL-17mRNA的表達(dá) 如前收集細(xì)胞1×106個，采用Trizaol試劑裂解PBMC提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。IL-17熒光定量PCR引物用Primer 5軟件設(shè)計(jì)，并由上海生物工程有限公司合成。IL-17上游為：TCTCCAAAGGAAGCCTGA，下游為：CAAGACTGAACACCGACTAAG，擴(kuò)增片段231bp。β-actin上游為：CACGAAACTACCTTCAACTCC，下游為：CATACTCCTGCTTGCTGATC，擴(kuò)增片段378bp，以cDNA作為模板在熒光定量PCR儀上測定。準(zhǔn)備反應(yīng)液，反應(yīng)條件為：94℃ 30s，56℃ 30s，72℃30s， 35個循環(huán)。擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后 進(jìn)行融解曲線分析。

1.2.4 ELISA法檢測血清IL-17的濃度 應(yīng)用ELISA 試劑盒進(jìn)行檢測， 按照說明書進(jìn)行操作，在波長為450nm下用酶標(biāo)儀測定OD值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有資料均采用（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組患者臨床資料的比較 各組患者在年齡、性別和冠心病危險(xiǎn)因素方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2各組冠心病患者及正常對照組外周血Th17細(xì)胞數(shù)量比較 AMI組和UA組患者外周血Th17細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞分別為（2.49±0.08）%， （2.43±0.07）%，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；AMI組和UA組患者外周血Th17細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞均明顯高于SA組（1.37±0.16）%和正常對照組（1.30±0.09）%， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而SA組和正常對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3各組冠心病患者及正常對照組外周血血漿IL-17水平比較 AMI組和UA組患者外周血IL-17水平分別為（37.53±9.28）ng/L，（34.11±5.56）ng/L，均明顯高于SA組（26.59±5.09）ng/L和正常對照組（22.81±3.42）ng/L， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而SA組和正常對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4各組冠心病患者及正常對照組外周血IL-17mRNA水平比較 AMI組和UA組患者外周血IL-17mRNA水平均明顯高于SA組和正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

急性冠狀動脈綜合征是由于冠狀動脈內(nèi)存在不穩(wěn)定的粥樣斑塊，在一定誘因的影響下，斑塊破裂引起冠狀動脈的狹窄加重、血栓形成，甚至完全閉塞，造成患者的心肌缺血、壞死，臨床類型包括不穩(wěn)定性心絞痛和急性心肌梗死。在不穩(wěn)定斑塊的破潰中， 免疫細(xì)胞和炎癥因子參與了AS的發(fā)生和發(fā)展，其中T淋巴細(xì)胞起著至關(guān)重要的作用[5-6]。目前研究表明冠心病患者體內(nèi)存在T淋巴細(xì)胞亞群失衡， 主要表現(xiàn)為Th1細(xì)胞功能亢進(jìn)[7]。而近年來發(fā)現(xiàn)一種新的CD4+T細(xì)胞亞型，即Th17細(xì)胞，它主要分泌IL-17、IL-21、IL-22等細(xì)胞因子[2]，在多種自身免疫疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。但有關(guān)Thl7細(xì)胞是否參與ACS發(fā)病機(jī)制的研究較少且結(jié)論不完全一致。多數(shù)研究表明IL -17促進(jìn)AS的發(fā)生[8]，但亦有研究表明IL-17可能對AS起保護(hù)作用[9]。

為進(jìn)一步明確Thl7細(xì)胞與ACS發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，本試驗(yàn)分別從細(xì)胞水平、分子水平和基因水平來探討Th17細(xì)胞在ACS發(fā)病中可能的作用機(jī)制。本研究中首先采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了AMI組、UA組、SA組及正常對照組受試者外周血中Thl7細(xì)胞表達(dá)占CD4+T細(xì)胞的比例，研究結(jié)果顯示AMI組和UA組受試者外周血中Thl7細(xì)胞比例顯著高于SA組和正常對照組；其次采用實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測4組受試者PBMC中Th17 mRNA表達(dá)水平， 結(jié)果顯示， IL-17 mRNA表達(dá)在AMI組和UA組中明顯升高；最后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測各組受試者外周血血漿IL-17的表達(dá)，結(jié)果顯示IL-17在AMI和UA組中表達(dá)顯著高于SA組和正常對照組。這提示AMI和UA患者體內(nèi)存在Th17細(xì)胞激活，它參與了全身或局部炎癥反應(yīng)加劇，促進(jìn)斑塊的不穩(wěn)定破潰，是ACS可能發(fā)病機(jī)制之一。我們知道，IL-17通過誘導(dǎo)粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）和IL-8分泌參與中性粒細(xì)胞募集反應(yīng)，可以促進(jìn)單核細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α和IL-1β， 并與其發(fā)揮協(xié)同作用， 進(jìn)一步加強(qiáng)炎癥反應(yīng)。此外，IL-17能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生產(chǎn)大量血管性假血友病因子（von Willebrand Factor， VWF），并通過激活線粒體途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)亡，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷或功能異常，創(chuàng)造促炎微環(huán)境從而促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展[10]。

Th17細(xì)胞的分泌異常參與了Th細(xì)胞亞群紊亂失衡，從而參與疾病發(fā)生發(fā)展，我們尚需進(jìn)一步研究探討Th17細(xì)胞與其他細(xì)胞及炎癥因子的相互關(guān)系，進(jìn)一步闡明ACS可能發(fā)病機(jī)制，從而為急性冠狀動脈綜合征炎癥干預(yù)提供新的治療新靶點(diǎn)，為患者帶來福音。

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