對氟喹諾酮類藥物耐藥的大腸埃希菌耐藥機(jī)制研究

1 藥物作用靶位的改變

抗生素的殺菌、抑菌作用是與細(xì)菌不同部位上的靶位蛋白結(jié)合，抑制其功能而生效。而細(xì)菌的耐藥則可以通過不同方式改變靶位蛋白結(jié)構(gòu)，使抗菌藥與其結(jié)合力下降或不能結(jié)合。DNA回旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ是喹諾酮類藥物的主要作用靶位。

1.1 DNA回旋酶 DNA回旋酶是由2個A亞基和2個B亞基構(gòu)成的四聚體，分別由gyrA 和gyrB基因編碼。gyrA和gyrB基因的突變只限于編碼一個氨基酸的3個堿基中的1個發(fā)生替換。gyrA的突變主要有4個位點(diǎn)，而且集中在較小的區(qū)域，將這一基因區(qū)段稱為氟喹諾酮耐藥決定區(qū)，已證實(shí)QRDR的突變與細(xì)菌耐藥有直接關(guān)系。只有氨基酸發(fā)生取代的堿基突變才可改變細(xì)菌對藥物的敏感性。gyrA的QRDR內(nèi)氨基酸取代方式、位置、取代位點(diǎn)的多少與E.coli耐藥水平有著密切的關(guān)系。尤其是gyrA基因改變最常見，其次是gyrB。gyrB基因突變較為單一，目前發(fā)現(xiàn)氨基酸的替換只有兩個比較集中的位點(diǎn)，即第426和447位，都為單個氨基酸替換。gyrB突變促進(jìn)gyrA突變耐藥性的產(chǎn)生，目前尚無資料表明gyrB突變作為獨(dú)立的耐喹諾酮類的機(jī)制。Ser83是gyrA 的基本突變點(diǎn)，gyrA基因中密碼子83發(fā)生突變常常造成大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥物耐藥。

1.2 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ是由2個C基因和2個E基因組成的四聚體，分別由parC和parE基因編碼。拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅣA亞單位和DNA 回旋酶A亞單位在NH2-末端有很高的同源性，即gyrA和parC的N末端均有與喹諾酮耐藥決定區(qū)域QRDR有關(guān)的區(qū)域，在此區(qū)發(fā)生氨基酸的替代影響了喹諾酮類藥物與酶結(jié)合的緊密關(guān)系，從而使其耐藥性增加。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ只是藥物的從屬靶位，DNA 回旋酶對氟喹諾酮類藥物比拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ更敏感。通過PCR擴(kuò)增大腸埃希菌耐藥株的gyrA QRDR區(qū)和parC基因，進(jìn)行PCR-SSCP分析；同時(shí)，PCR擴(kuò)增marOR基因，在耐藥株中隨機(jī)選取進(jìn)行測序，檢測marOR基因突變情況。發(fā)現(xiàn)gyrA和parC基因突變引起大腸埃希菌產(chǎn)生耐藥，Chenia HY等報(bào)道ParC突變發(fā)生在Ser-80/Glu-84，gyrA基因突變是產(chǎn)生對氟喹諾酮類耐藥的主要原因，parC基因突變可引起菌株對氟喹諾酮類藥物的高水平耐藥。

2 膜通透性屏障及相關(guān)基因突變

大腸埃希菌增加抗生素滲透障礙的主要方式是改變跨膜通道孔蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)，使其與抗生素結(jié)合力下降，以及減少跨膜通道孔蛋白數(shù)量甚至使之消失，從而減少藥物在細(xì)胞內(nèi)的積聚。大腸埃希菌外膜上存在多種外膜蛋白（Omp），主要有OmpA、OmpF、OmpC和蛋白K。其中外膜蛋白F（outer member protein F，OmpF）和外膜蛋白C（outer member protein C，OmpC）為大腸桿菌的主要外膜蛋白。OmpF和OmpC在大腸桿菌中的表達(dá)以協(xié)調(diào)方式緊密相關(guān)，以保持外膜蛋白總量的恒定。當(dāng)細(xì)菌染色體的基因突變引起膜通透性降低影響藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，細(xì)菌即可發(fā)生耐藥。在耐氟喹諾酮大腸埃希菌的染色體上已發(fā)現(xiàn)norB、norC、nfxc、nfxB和cfxB等多個染色體突變基因，攜帶這些突變基因的耐藥株幾乎都具有相同的表型-Omp的異常，尤其是作為親水性小分子藥物通道的OmpF的減少或缺失，使細(xì)菌對氟喹諾酮類藥物的攝入減少。OmpC通道缺失的菌株對氟喹諾酮類藥物的敏感性似乎不變，提示OmpF減少或缺失是細(xì)菌膜通透性降低的主要因素。OmpF的表達(dá)是通過micF基因調(diào)控的，它編碼一小段反義RNA，與OmpF的mRNA5-末端互補(bǔ)，從而阻止OmpF的翻譯過程，最終導(dǎo)致OmpF的蛋白合成量降低。對大腸埃希菌norC突變株的研究表明，僅由膜通透性降低所引起的藥物蓄積濃度減少極其有限，這提示除OmpF異常外，一定還存在其他引起藥物蓄積濃度的降低的決定因素。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)具有粗糙LPS的大腸埃希菌內(nèi)環(huán)丙沙星蓄積量高于具有光滑LPS的菌株，并且與OmpF的表達(dá)無關(guān)。

3主動外排活躍

主動外排系統(tǒng)是指細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜存在能量依賴性蛋白外排泵，通過主動外排作用將藥物從菌體排出，使達(dá)到作用靶位的藥量明顯減少，不足以發(fā)揮殺菌或抑菌作用。目前發(fā)現(xiàn)與氟喹諾酮類藥物耐藥性有關(guān)的主動外排系統(tǒng)均為多重藥物外排泵。多重藥物外排泵根據(jù)其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用方式及消耗能量的來源不同分為兩類：一類是以質(zhì)子驅(qū)動力為能量，以\"H-藥物\"方式向細(xì)胞外作反向轉(zhuǎn)運(yùn)；另一類為ABC，以ATP驅(qū)動力為能量，由ATP結(jié)合盒向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)。大腸埃希菌以前者為主，前者按轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分子結(jié)構(gòu)、同源性及作用方式又可分為4類。大腸埃希菌與氟喹諾酮類藥物耐藥性有關(guān)的主動外排泵有3個：AcrAB、MdfA和NorE。其中AcrAB-TolC系統(tǒng)為主要代表，是目前耐藥研究中的熱點(diǎn)，屬于質(zhì)子依賴型，能夠產(chǎn)生對多種抗菌藥的高水平的多重耐藥。AcrAB-TolC系統(tǒng)主要由細(xì)胞內(nèi)膜泵（AcrB）通過跨膜融合蛋白（AcrA）與外膜的排除泵（TolC）連接而組成。通常情況下AcrAB-TolC系統(tǒng)處于低水平表達(dá)，但在選擇性壓力下會去阻遏出現(xiàn)高表達(dá)。發(fā)現(xiàn)，藥物分子外排主要和H 相偶聯(lián)，它們構(gòu)成一個反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通道開放后，H由于濃度梯度內(nèi)流，藥物分子隨即外排。AcrAB由acrAB操縱子編碼，而編碼外膜蛋白TolC 的基因tolC則位于染色體的其它區(qū)域。acrAB的表達(dá)受多種調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，MarA、RobA、SoxS是aerAB的正調(diào)控蛋白，可同時(shí)增加AcrAB和tolC的表達(dá)。Jellen-Ritter等研究表明acrR是位于acrAB基因上游的阻遏蛋白基因，可通過直接增加AcrR數(shù)量阻止acrAB超表達(dá)，acrR突變?nèi)プ瓒簦部墒筧crAB表達(dá)增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)acrAB缺失突變體也表現(xiàn)出對氟喹諾酮類藥物耐藥性和多重藥物耐藥表型。另外MppA對acrB的轉(zhuǎn)錄起負(fù)調(diào)節(jié)作用，mppA的無意義突變株中外膜蛋白OmpF的表達(dá)也減少了，可與外排泵產(chǎn)生協(xié)同耐藥。主動外排泵激活劑（葡萄糖）和抑制劑（氰氯苯腙）對氟喹諾酮類藥物在菌體內(nèi)蓄積量的影響，證明主動外排泵對相對親水性氟喹諾酮類藥物的泵出功能明顯強(qiáng)于其對疏水性氟喹諾酮類藥物的作用。

綜上所述，大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制：藥物作用靶位的改變、膜通透性降低及主動外排活躍、質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機(jī)制，可單獨(dú)或協(xié)同作用，使細(xì)菌發(fā)生對氟喹諾酮類藥物耐藥，甚至多重耐藥。因此我們應(yīng)該合理使用抗感染藥物，研究細(xì)菌耐藥機(jī)制以及抗生素療效評價(jià)，尋找和研制有抗菌活性的新抗菌藥物，同時(shí)尋找有效的酶抑制劑。

參考文獻(xiàn)：

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編輯/丁一