姜黃素在小鼠肝泡狀棘球蚴中對TNF—α和TNF—β的影響

摘要：目的 初步探討姜黃素在小鼠肝泡狀棘球蚴生長發(fā)育過程中對TNF-α和TNF-β的影響。 方法 選取132只18w齡健康雌性昆明小鼠，隨機分為6組（n=22）：姜黃素組、姜黃素溶劑注射組、阿苯達唑組、姜黃素+阿苯達唑聯(lián)合用藥組、模型對照組、空白對照組。除空白對照組外，其余各組小鼠均采用20%烏拉坦腹腔注射麻醉后，切開皮膚經(jīng)腹壁肌層肝穿刺對肝臟注射0.1mlE.m組織混懸液，制備小鼠肝泡狀棘球蚴模型，空白對照組注射等量的生理鹽水。接種60d后再灌胃飼養(yǎng)60d，然后提取各組小鼠血清采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測各組小鼠血清中TNF-α和TNF-β的含量。結(jié)果 感染了E.m的小鼠血清中TNF-α、TNF-β的表達量明顯高于空白組（P<0.05）；用藥組TNF-α和TNF-β的表達量明顯低于模型組（P<0.05）；姜黃素組、阿苯達唑組和聯(lián)合用藥組TNF-α和TNF-β的表達量無統(tǒng)計學差異性（P>0.05）。結(jié)論 姜黃素可以使肝泡狀棘球蚴模型小鼠血清中TNF-α和TNF-β的表達量降低。

關(guān)鍵詞：姜黃素；泡狀棘球蚴；TNF-α；TNF-β

泡型棘球蚴病（Alveolar echinococcus，AE）是由多房棘球蚴絳蟲（Echinococcus multilocularis，E.m）幼蟲引起的一種致死性人獸共患寄生蟲病。不經(jīng)治療者10年致死率可達93%以上[1]?；颊咝g(shù)后復發(fā)率高[2]，藥物治療是目前最主要的治療手段。大量研究表明，姜黃素（Curcumin）具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤和抗多種寄生蟲病等作用，且價格低廉、副作用小。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，泡狀棘球蚴的浸潤性生長和轉(zhuǎn)移與腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）等炎性因子密切相關(guān)。本研究假設Cur對E.m有治療作用，建立肝泡狀棘球蚴小鼠模型，通過灌藥的方式進行干預，檢測TNF-α和TNF-β在小鼠血清中的表達，初步探討姜黃素在小鼠肝泡狀棘球蚴生長發(fā)育過程中對TNF-α和TNF-β的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1種鼠和實驗動物 24w齡灰倉鼠（泡球蚴腹腔保種16w）2只，體重分別為56g、59g；18w齡健康雌性昆明小鼠132只，體重（25+5）g，均購于新疆自治區(qū)疾病控制中心。

1.1.2主要試劑和儀器 姜黃素和姜黃素溶劑（羧甲基纖維素鈉）均購于美國Sigma-Aldrich公司，阿苯達唑采用臨床治療所用阿苯達唑藥劑，小鼠TNF-α ELISA試劑盒、小鼠TNF-βELISA試劑盒均購于美國USCN公司，xMark酶標儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將132只18w齡[3]健康雌性昆明小鼠隨機分為姜黃素組、姜黃素溶劑注射組、阿苯達唑組、姜黃素+阿苯達唑聯(lián)合用藥組、模型對照組、空白對照組。除空白對照組外其余各組小鼠每只均接種0.1mlE.m混懸液。

1.2.2 動物模型的建立 對種鼠行頸椎脫臼快速處死并固定于操作臺，無菌條件下常規(guī)開腹，選取腹腔中光滑、游離、透亮、成簇的泡球蚴組織，充分剔除宿主的系膜及纖維組織后，用含雙抗（100U/ml青霉素和鏈霉素）的無菌PBS液漂洗3次，剪碎、研磨、80目鋼篩過篩，再用無菌PBS液（含雙抗）沖洗，靜止5分鐘，抽吸上清液和部分渾濁液，重復3次，徹底剔除宿主細胞及壞死組織，加青霉素和鏈霉素250IU/ml，配 成 濃 度20%的混懸液，0.5%伊紅染色后高倍鏡下觀察泡狀棘球蚴原頭節(jié)活性。活性頭節(jié)，1-3/高倍鏡視野，結(jié)構(gòu)清晰，著色率<15%。20%烏拉坦麻醉（4ml/kg）后采用切開上腹部經(jīng)腹壁肌層透視下肝穿刺接種[4]，每只注射0.1mlE.m混懸液。

1.2.3 各組小鼠的灌胃 空白對照組和模型對照組小鼠不進行灌胃，姜黃素組每只小鼠7.5mg/d，姜黃素溶劑組（0.5%纖維素鈉溶液）每只小鼠0.2ml/d，阿苯達唑組每只小鼠1.25mg/d，姜黃素+阿苯達唑聯(lián)合用藥組每只小鼠1.25mg阿苯達唑+1.25mg姜黃素/d，接種E.m60d后持續(xù)灌胃60d，最后一次灌胃于處死小鼠4h前進行。

1.2.4 小鼠血清的采取 對各組小鼠行摘眼球取血，置于生化管中后3000r/min離心25min，取上清液即血清-20°C凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 采用ELISA試劑盒對各組小鼠血清樣本進行TNF-α、TNF-β檢測，通過酶標儀讀取吸光度（OD）值，并最終計算出濃度。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 實驗結(jié)果以率和（x±s）表示，多組之間感染率的比較采用x2檢驗；各組Elisa結(jié)果用（x±s）描述，采用方差分析；按α=0.05為水準，以P<0.05為統(tǒng)計學有顯著差異性。采用SPSS17.0軟件分析處理。

2 結(jié)果

2.1 造模情況 各組小鼠感染率（肝臟成功感染E.m小鼠數(shù)量/每組小鼠數(shù)量）無統(tǒng)計學差異性（P>0.05），飼養(yǎng)過程中死亡的小鼠解剖后觀察是否成功感染E.m，肝臟上有泡球蚴組織的小鼠同樣計入成功感染小鼠；最終各組存活小鼠數(shù)量，見表1。

2.2 大體觀察 肝泡狀棘球蚴組可見包蟲組織呈多發(fā)的、大小不等的簇擁成結(jié)節(jié)狀，團塊狀的小囊泡，表面凹凸不平，大部分囊泡透亮，少部分略帶渾濁，與正常肝臟組織分界不清（見圖1）。

2.3 血清中TNF-α和TNF-β濃度檢測結(jié)果 見表2。

3討論

泡狀棘球蚴感染宿主之后，原頭節(jié)的增殖會導致病灶逐漸擴大，嚴重侵害肝臟，并可使肝臟發(fā)生纖維化。同時還可通過浸潤擴散、血行播散、淋巴轉(zhuǎn)移和種植轉(zhuǎn)移的方式，發(fā)生似惡性腫瘤樣轉(zhuǎn)移，侵襲肺、脾臟等器官。目前臨床用藥多為單一的苯并咪唑類藥物為主，但毒副作用大，因此有效的副作用小的抗包蟲藥物的研究是目前主要的研究方向之一。

有研究表明，在泡球蚴感染中，囊泡周圍的肉芽腫和外周血中均可檢測到TNF-α的表達。本課題組前期研究結(jié)果顯示：泡球蚴感染宿主后，可引起TNF-α蛋白高表達，而TNF-α參與了誘導泡球蚴周圍宿主單核細胞的凋亡，從而抑制宿主的免疫功能，以達到在宿主體內(nèi)生長、發(fā)育的目的[5]。TNF-β雖然與TNF-α來源于不同細胞，但它們有30%左右的同源性[6]，作用于共同受體TNFR，廣泛參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應，可以促纖維細胞生長和促膠原分泌，從而參與機體的纖維化進程[7]。本研究結(jié)果顯示，TNF-β在各組小鼠血清中的表達趨勢與TNF-α大致相同，感染了E.m的小鼠血清中TNF-α和TNF-β的表達明顯高于空白組（P<0.05）；用藥組小鼠血清中TNF-α和TNF-β的表達明顯低于模型組（P<0.05）。

本研究顯示姜黃素可降低肝泡狀棘球蚴模型小鼠血清中TNF-α和TNF-β的表達，且姜黃素組與阿苯達唑組和聯(lián)合用藥組TNF-α和TNF-β表達無沒明顯差異（P>0.05）。楊維泓等[8]發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制小鼠腫瘤血管內(nèi)皮細胞生長的作用。Jon等[9]發(fā)現(xiàn)姜黃素可以將人乳腺癌細胞阻斷于M期，從而抑制其增殖。Duvoix等[10]報道姜黃素還能阻斷TNF-a的表達，抑制谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的mRNA表達來誘導K562白血病細胞的凋亡。此外，Allam等[11]報道，姜黃素可以調(diào)節(jié)曼氏血吸蟲宿主血中的IL-12和TNF-α，促進嗜酸性粒細胞的生成，有效的抑制曼氏血吸蟲在宿主體內(nèi)的生長發(fā)育，同時可以減輕宿主肝纖維化的程度。由此我們推斷，姜黃素可能通過①抑制泡球蚴血管生成；②誘導細胞周期阻滯；③調(diào)節(jié)凋亡抑制基因的表達；④減輕宿主肝纖維化程度；⑤調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)炎性因子的表達等方式作用于泡狀棘球蚴。

綜上所述，姜黃素可以降低肝泡狀棘球蚴模型小鼠血清中TNF-α和TNF-β的表達，且具有分子量小、親脂性強，體內(nèi)易被腸道和肝臟迅速代謝，毒副作用小等特點。但姜黃素在泡狀棘球蚴小鼠模型中的具體作用機制，以及是否可以用作臨床抗包蟲藥物還有待于進一步研究。

參考文獻：

[1]郭永忠，丁木拉提，朱馬拜等.肝泡狀棘球蚴病合并肺、腦轉(zhuǎn)移[J].中華肝膽外科雜志，2005，11（7）：493-494.

[2]Sezgin O， Altintas E， Saritas U，et al.Hepatic alveolar echinococcosis： clinical and radiologic features and endoscopic management[J].J Clin Gastroenterol，2005， 39（2）：160-167.

[3]夏海洋，趙階峰，楊宏強，等.年齡對小鼠繼發(fā)性肝泡狀棘球蚴模型的影響[J].中國人獸共患病學報，2014，30（7）：723-726.

[4]卞志遠，馬少波，夏海洋，等.新型肝穿刺建立原發(fā)性肝多房棘球蚴病小鼠模型[J].中國人獸共患病學報，2013，29（5）：452-455.

[5]楊宏強，馬少波，卞志遠，等.腫瘤壞死因子-α和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在肝泡型棘球蚴周圍單核細胞中的表達.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2012，30（3）：201-205.

[6]劉艷，金瑋，陸林，等.腫瘤壞死因子β基因A80C多態(tài)與原發(fā)性高血壓[J].內(nèi)科理論與實踐，2009，4（2）：121-123.

[7]Fischer GF， Mayr WR.Molecular genetics of the HLA complex.Wien Klin wochenschr 2001，113（20-21）：814-824.

[8]楊維泓， 姚慶華， 徐玉芬，等. 姜黃素對Lewis肺癌小鼠TGF-β1、Smad3、Smad7表達的影響[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2012， 22（4）： 259-261.

[9]Jon M，Holy J M. Curcumin disrupts mitotic spindle structrue nd induces micronucIeation in MCF-7 breast cancer ceIls[J]. Mut Res， 2002， 518（1）： 71-84.

[10]Dauoix A，Morceau F，Delhalle S，et al.Induction of apoptosis by curumin：medlation by glutathione S-transferase P1- linhibition[J]. Biochem Pharmacol， 2003， 66（8）：1475-1483.

[11]Allam G.Immunomodulatory effects of curcumin treatment on murine schistosomiasis mansoni [J].Immunobiology， 2009， 214 （8）：712-727.

編輯/蘇明哲