油紅O和蘇丹Ш染色劑對(duì)脂肪樣病變肝組織脂質(zhì)染色效果的比較

摘要：目的 比較油紅O和蘇丹Ш染色劑對(duì)脂肪樣病變肝組織脂質(zhì)染色效果。方法 選取高脂飲食小鼠脂肪樣病變肝組織，分別用油紅O和蘇丹Ш染色劑進(jìn)行染色，比較肝組織內(nèi)脂肪滴的染色效果及脂肪滴的輪廓界面清晰度。結(jié)果 脂肪樣肝病變組織經(jīng)蘇丹Ⅲ染色后，肝組織內(nèi)脂肪滴被染成橘紅色，或淡橘紅色，但是大多數(shù)被染脂肪滴的輪廓界面不清晰；相反，經(jīng)油紅O染色肝細(xì)胞內(nèi)的脂肪滴呈紅色或鮮紅色，而且大多數(shù)被紅染的脂肪滴的輪廓界面清晰。結(jié)論 油紅O進(jìn)行脂肪樣病變肝組織脂質(zhì)染色效果好于蘇丹Ш染色。

關(guān)鍵詞：脂肪樣病變肝組織；油紅O染色；蘇丹Ш染色

肝脂肪樣病變是肝纖維化、肝硬化甚至肝癌的過(guò)渡階段，當(dāng)前臨床上采用超聲等影像學(xué)檢查方法為其診斷提供了極大的便利，然而要想準(zhǔn)確地掌握肝脂肪樣病變的病變程度、主要病理特征等內(nèi)容，以便更有效第進(jìn)行防治，顯然單靠影像學(xué)手段難以達(dá)到預(yù)期目標(biāo)[1-2]。在這方面，傳統(tǒng)的染色法就顯示出了其較好的優(yōu)勢(shì)。比如，通過(guò)染料染色后，可以清楚地觀察到肝胞脂肪變、肝細(xì)胞氣球樣變、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等主要病理特征，為肝脂肪樣病變的預(yù)防和治療提供極大的保障[3]。近年來(lái)，很多臨床一線的醫(yī)務(wù)工作者和研究人員在嘗試著在傳統(tǒng)的染料中找到一種/幾種最佳染料，通過(guò)將脂質(zhì)染色，準(zhǔn)確地了解肝脂肪樣病變程度。近年來(lái)，我們課題組在分析現(xiàn)有的蘇丹Ⅲ、蘇丹Ⅳ、油紅O、尼羅藍(lán)等脂溶性染料的基礎(chǔ)上[4-5]。通過(guò)多樣本及和三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室合作研究，發(fā)現(xiàn)上述染料中以油紅O和蘇丹Ⅲ進(jìn)行脂質(zhì)染色較好，通過(guò)進(jìn)一步比較油紅O和蘇丹Ⅲ的脂質(zhì)染色效果，發(fā)現(xiàn)油紅O顯好于蘇丹Ⅲ明。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)進(jìn)行了總結(jié)，以供臨床參考。

1資料與方法

1.1一般資料 小鼠經(jīng)過(guò)高脂飲食造模，使肝組織發(fā)生脂肪樣變。動(dòng)物經(jīng)乙醚麻醉，甲醛-鈣液灌注固定。取固定好后的肝組織，冰凍切片，切片厚8～10μm。

1.2試劑 油紅O，上?；瘜W(xué)試劑分裝廠；蘇丹Ⅲ，上?；瘜W(xué)試劑總廠第三分廠；95%乙醇，國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.3試劑配制 油紅O染色液：準(zhǔn)確稱量油紅O：0.5g，溶解于70%乙醇中，配制成0.5%油紅O溶液，置于磨口瓶?jī)?nèi)保存?zhèn)溆?。注意染液用前過(guò)濾、即用即配。蘇丹Ⅲ染色液：準(zhǔn)確稱量蘇丹Ⅲ 0.5g，溶解于70%乙醇中，配制成0.5%蘇丹Ⅲ溶液，過(guò)濾后置于磨口瓶?jī)?nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4染色步驟 油紅O 染色步驟：常規(guī)冷凍切片將小鼠肝組織切成8～10μm薄片，冷風(fēng)機(jī)吹干，然后用10% 福爾馬林/1% CaCl2固定液固定15min，50%乙醇漂洗1min，油紅O染液染色15min，50%乙醇分化漂洗，水洗終止分化，然后蘇木素復(fù)染核，自來(lái)水浸泡30min返藍(lán)，用甘油明膠封片。蘇丹Ⅲ染色驟：常規(guī)冷凍切片將小鼠肝組織切成8～10μm薄片，冷風(fēng)機(jī)吹干，然后用雙蒸水洗2min，50%乙醇漂洗1～5min，蘇丹Ⅲ染液染色15～20min，50%乙醇分化漂洗，水洗終止分化，然后蘇木素復(fù)染核，自來(lái)水浸泡30min返藍(lán)，用甘油明膠封片。

2結(jié)果

由于肝脂肪樣病變的主要病理特征是肝組織中脂質(zhì)較正常肝組織的含量高，細(xì)胞內(nèi)的脂肪滴主要以大泡、多囊泡特征，此外也可見肝細(xì)胞腫脹、變形，排列不規(guī)則等變化。通過(guò)蘇丹Ⅲ染色和油紅O染色進(jìn)行肝脂肪樣病變組織染色發(fā)現(xiàn)，脂肪樣肝病變組織經(jīng)蘇丹Ⅲ染色后，肝組織內(nèi)脂肪滴雖然被染成橘紅色，或淡橘紅色，但是大多數(shù)被染脂肪滴的輪廓界面不清晰；相反，經(jīng)油紅O染色肝細(xì)胞內(nèi)的脂肪滴呈紅色或鮮紅色，而且大多數(shù)被紅染的脂肪滴的輪廓界面清晰，見圖1。

3討論

近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，各種不良生活方式的影響，肝脂肪樣患者愈來(lái)愈多，并且年齡逐步趨向于年輕化。隨著超聲等影像學(xué)檢查的廣泛普及，肝脂肪樣病變發(fā)現(xiàn)率明顯提高，重癥脂肪肝B 超檢出率在95% 以上[6-8]。當(dāng)前，它和高血壓、糖尿病一樣，成為當(dāng)代人常見的慢性病之一，成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，它可以進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌，發(fā)展為肝硬化和肝癌的比例分別為5%～10% 和1%～2%，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康[9-11]。因此，采取準(zhǔn)確可靠地診療手段就顯得尤為重要。當(dāng)前采取的影像學(xué)檢查為其早發(fā)現(xiàn)提供了可能，但是如果能夠?qū)⑵渑c肝組織形態(tài)學(xué)分析結(jié)合起了，將肝的脂肪樣的防治提供更直觀地保障。我們的實(shí)驗(yàn)研究就較好的地實(shí)現(xiàn)了這一目標(biāo)。

總所周知，油紅O為脂溶性染料，在脂肪中能很好地溶解，并可特異性的使組織內(nèi)甘油三酯等中性脂肪著色；而蘇丹Ⅲ是弱酸性染料，呈紅色粉末狀，易溶于脂肪和酒精，也是非常常用的用于顯示脂類物質(zhì)的染色劑。但是哪種染料更適合于肝脂肪樣變，尚不清楚。我們通過(guò)仔細(xì)分析肝脂肪樣病變的發(fā)病機(jī)理和病理特征后，發(fā)現(xiàn)，肝臟脂肪樣變雖也表現(xiàn)為甘油三酯的含量高，但與人體的脂肪組織相比存在著較大的差異，比如：脂質(zhì)總量少，脂肪滴分散、粒徑小等[3，5]。因此，對(duì)脂質(zhì)染料的選擇要求較高。染色時(shí)如果把握不好，其結(jié)果是：要么染色不到位，要么造成組織內(nèi)的脂肪丟失，或結(jié)構(gòu)受損，進(jìn)而影響準(zhǔn)確的診斷。所以，好的染色效果，對(duì)我們充分利用結(jié)果、獲得更多也更準(zhǔn)確的信息至關(guān)重要。油紅O屬于偶氮染料，是很強(qiáng)的脂溶劑和染脂劑，與甘油三酯結(jié)合呈小脂滴狀。實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，油紅O所染脂肪滴結(jié)果色彩更為鮮亮，反差更為明顯，脂肪滴輪廓界面清晰更為清晰，對(duì)于細(xì)微一些的脂滴，也有良好的顯示效果。相反，蘇丹Ⅲ染料所染脂肪滴呈橘黃色，色彩不夠艷麗，反差不夠明顯，染色均勻度也較差，對(duì)染色較大脂肪滴顯示尚可，而對(duì)較小的脂肪滴滴顯示效果不夠理想。由于肝臟脂肪樣變中，其脂肪滴的特點(diǎn)是脂質(zhì)總量少，脂肪滴分散、粒徑小，因而選用油紅O進(jìn)行肝臟脂肪樣變脂質(zhì)染色效果好。

綜上所述，對(duì)于以肝脂肪樣變的組織來(lái)說(shuō)，欲要使組織內(nèi)的脂肪成分得到良好的顯示，選擇油紅O將會(huì)比蘇丹Ⅲ取得更好的染色效果。

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編輯/馮焱