新穎的基因治療運載工具—AAV9腦內(nèi)表達研究

摘要：基因治療研究中顯示血腦屏障是基因治療中的最大障礙，目前多數(shù)基因載體需要復(fù)雜的手術(shù)進行腦內(nèi)注射后進行目的基因在特定腦區(qū)的表達，本研究探討AAV9作為新型基因運載工具在基因治療的作用。結(jié)果顯示尾靜脈注射AAV9后，AAV9可以高效的通過血腦屏障，同時誘導(dǎo)目的基因有效表達。AAV9病毒可以作為基因治療的載體工具病毒。

關(guān)鍵詞：AAV9；基因治療；GFP；血腦屏障

迄今為止，大約有100%的大分子藥物和98%的小分子沒有辦法通過血腦屏障，從而限制許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物開發(fā)工作?；蛑委熥鳛檫z傳疾病治療的另一種方法，需要將基因運送至中樞系統(tǒng)（大腦和脊髓）內(nèi)，同樣面臨著血腦屏障的障礙[1]。根據(jù)大量中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床實驗結(jié)果顯示AAV載體能夠持續(xù)將目的基因轉(zhuǎn)運到目標腦區(qū)并穩(wěn)定表達，同時安全性高，副反應(yīng)小，但是該病毒載體需要通過腦部手術(shù)通過立體定位等方式注射到目標腦區(qū)，因此對于基因治療研究來說急需一種能夠外周給藥后很好的通過血腦屏障，目標基因表達量高，同時生物安全比較高的基因運輸載體。

AAV（腺相關(guān)病毒）分為2型，6型和8型目前研究中廣泛使用，最近研究的發(fā)現(xiàn)AAV9，該型AAV具有強大的、多組織器官轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，全身靜脈或腹腔內(nèi)注射后AVV病毒能夠在多種組織如骨骼、肌肉和心臟等器官內(nèi)廣泛表達。分子生物學(xué)研究顯示AAV9能夠有效地跨越血管內(nèi)皮細胞障礙，然而該型病毒是否能夠跨過血腦屏障并發(fā)揮載體運輸?shù)淖饔弥两裎粗?，本研究利用AVV9-GFP為載體，利用小鼠尾經(jīng)脈注射AAV9檢測其在中樞系統(tǒng)內(nèi)的表達情況為AVV9[2]。

1資料與方法

1.1實驗動物 20只C57BL/6小鼠（雄性）用于實驗，體重22～30g，月齡8～12w，12h晝夜交換，濕度（22±0.5）℃，動物操作符合《徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物操作和倫理委員會工作條例》。

1.2 AVV9病毒 AVV9病毒包裝由山東唯真生物科技有限公司完成，由CMV做啟動子建立GFP融合蛋白（AAV9-GFP），病毒滴度21012，qPCR檢測病毒拷貝數(shù)用以確定病毒滴度。病毒使用1ml注射器進行小鼠尾靜脈注射后，注射后動物返回飼養(yǎng)籠內(nèi)，3w后進行灌流、熒光顯微鏡拍照。

1.3動物灌流 小鼠腹腔注射水合氯醛（4%）深度麻醉后進行腦組織灌流。暴露心臟形左心室主動脈插管進行0.9%生理鹽水灌流（100ml）后進行4%多聚甲醛灌流，灌流需要緩慢滴注，待腦組織變硬再滴注15min多聚甲醛，剝離腦組織4%多聚甲醛過夜。第2d取出腦組織放入梯度蔗糖溶液脫水處理：蔗糖溶解在0.01M PBS（PH 7.2～7.5）配置成10%，20%和30%蔗糖溶液，從低濃度到高濃度，待腦組織沉底后更換下一個濃度蔗糖溶液。脫水處理后腦組織使用冰凍切片機（萊卡4510）進行冠狀腦切片（30um）在-20℃冰箱保

1.4熒光顯微鏡成像 成像前腦組織置于室溫復(fù)溫15min，然后腦片中滴50ul PBS后在熒光顯微鏡下觀察GFP蛋白表達。

2結(jié)果

小鼠經(jīng)脈注射AAV9病毒3w后，經(jīng)大腦灌流切片后發(fā)現(xiàn)多個腦區(qū)被AAV9感染具有GFP蛋白表達。我們發(fā)現(xiàn)運動皮層，聽覺皮層，視覺皮層，體感皮層，內(nèi)側(cè)前額葉皮層，紋狀體均有信號表達，說明小鼠經(jīng)脈注射AAV9-GFP后，病毒能夠透過血腦屏障感染神經(jīng)系統(tǒng)，同時進一步分析顯示AAV9不但能夠過血腦屏障而且還可以穩(wěn)定表達，腦內(nèi)多個腦區(qū)均有融合GFP蛋白的廣泛表達（圖1）。

3討論

我們的實驗結(jié)果顯示AAV9能夠有效的通過血腦屏障，腦內(nèi)運動皮層，聽覺皮層，視覺皮層，體感皮層，內(nèi)側(cè)前額葉皮層，紋狀體多個腦區(qū)能夠穩(wěn)定表達。該研究結(jié)果證實AAV9具有一種獨特的能力就是穿過血腦屏障。注射AAV9-GFP后在眾多腦區(qū)，我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元大量的轉(zhuǎn)導(dǎo)在AAV9的運輸中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果有理由為提供深入的病毒基因轉(zhuǎn)移機制的AAV9為基礎(chǔ)的載體[3]。以前研究顯示的血腦屏障是保護大腦免受外界干擾侵襲的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，同時也是基因治療技術(shù)的一個障礙。實驗動物研究顯示，多種病毒載體能夠介導(dǎo)基因在腦內(nèi)表達，但幾乎都是通過手術(shù)的辦法將攜帶治病基因的病毒如AAV，慢病毒注射到目標腦區(qū)，這樣的操作不但負責，而且在臨床缺乏可操作性[4]，所以尋找一個高效通過血腦屏障同時又可以穩(wěn)定基因表達的載體，我們的結(jié)果為該難題提供了一個可供參考的運載工具病毒。

參考文獻：

[1]C.M.Weismann，J.Ferreira，A.M.Keeler，Q.Su，L.Qui，S.A.Shaffer，Z.Xu，G.Gao，M.Sena-Esteves，Systemic AAV9 gene transfer in adult GM1 gangliosidosis mice reduces lysosomal storage in CNS and extends lifespan[J].Hum Mol Genet 24（2015）4353-4364.

[2]J.M.Brito-Armas，J.Castro-Hernandez，M.Rodriguez-Diaz，R.Castro-Fuentes，[Non invasive gene therapy in neurological diseases[J].Rev Neurol 52（2011）603-617.

[3]M.Chuah，T.Vandendriessche，Gene therapy for hemophilia\"A\"and\"B\"：efficacy，safety and immune consequences[J].Verh K Acad Geneeskd Belg 69（2007）315-334.

[4]E.M.Donnelly，N.M.Boulis，Update on gene and stem cell therapy approaches for spinal muscular atrophy[J].Expert Opin Biol Ther 12（2012）1463-1471.

編輯/丁一