肽核酸探針在微生物診斷領(lǐng)域中的應(yīng)用

摘要：肽核酸（PNA）是近年發(fā)展起來(lái)的一種脫氧核糖核酸類似物，其可通過(guò)與DNA以及RNA進(jìn)行特異性結(jié)合，制成探針，被稱為PNA探針。相較于DNA探針，其特異性以及穩(wěn)定性均有所增加，可以大幅度提高微生物學(xué)檢測(cè)的靈敏度，也可以提高診斷效率，對(duì)PNA探針進(jìn)行繼續(xù)研究十分具有臨床價(jià)值。

關(guān)鍵詞：肽核酸；探針；微生物；診斷

肽核酸是1991年由丹麥科學(xué)家Nielsen等設(shè)計(jì)的以中性酰胺鍵為骨架的DNA類似物，其骨架結(jié)構(gòu)單元為（2-氨乙基）甘氨酸，堿基部分通過(guò)亞甲基碳基與主骨架氨基連接，可以與DNA特異性結(jié)合[1]。其骨架為電中性，與DNA-DNA或RNA-DNA相比不存在靜電排斥作用，因此具有很高的核酸親和性及熱穩(wěn)定性。目前根據(jù)不同微生物的特點(diǎn)和診斷方法的要求進(jìn)行微生物快速診斷主要有三種策略：①分離培養(yǎng)后快速鑒定；②短時(shí)間富集后檢測(cè)；③直接檢測(cè)。針對(duì)rRNA的PNA探針已經(jīng)成功運(yùn)用于以上三種方式，而且能夠提供了更快速準(zhǔn)確的結(jié)果，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種檢測(cè)模式，如基于玻片的熒光原位雜交，基于濾膜的熒光原位雜交、化學(xué)發(fā)光原位雜交、液相雜交、Q-PNA PCR等。隨著以rRNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的微生物分類學(xué)的發(fā)展，兩者結(jié)合正在共同推進(jìn)微生物診斷技術(shù)的快速發(fā)展。

1 PNA技術(shù)

1.1 PNA探針 PNA特殊的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)使其作為探針在微生物診斷領(lǐng)域顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。PNA探針一般是指序列長(zhǎng)度為13～18bp的寡聚PNA，其長(zhǎng)度比DNA探針短。電中性的骨架使PNA具有比DNA更高的雜交親和性和堿基配對(duì)特異性，并可以通過(guò)單堿基錯(cuò)配來(lái)分辨不同的核酸序列。PNA探針雜交條件也比DNA探針溫和，低離子濃度下也可以發(fā)生雜交，且能夠抵抗核酸酶和蛋白酶的降解。

1.2自身報(bào)告的PNA探針 LightUp探針和LightSpeed探針是熒光標(biāo)記的PNA探針，LightUp探針是偶聯(lián)有唾哇橙染料的PNA探針，LightSpeed探針是雙標(biāo)記的PNA探針，即在PNA分子的兩端分別聯(lián)上熒光染料和淬滅劑。在水溶液環(huán)境中，LightSpeed探針的構(gòu)象使熒光染料和淬滅染料彼此靠的很進(jìn)，熒光被淬滅。當(dāng)探針與靶序列結(jié)合時(shí)，熒光劑和淬滅劑在空間上得到分開，使PNA的熒光染料發(fā)出熒光。LightUp探針在非雜交狀態(tài)下是內(nèi)在非熒光的，當(dāng)探針與靶序列結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光，但這種發(fā)光效應(yīng)與PNA的序列有很大程度的相關(guān)性，目前這種關(guān)系機(jī)制還沒有完全清楚。這兩種探針都可以用于實(shí)時(shí)PCR分析，并且具有很高的敏感性和特異性。

1.3 PNA阻斷探針 PNA探針與DNA探針相比，特異性雖然明顯增強(qiáng)，但其特異性還不能足夠精確區(qū)分與靶標(biāo)分子親緣關(guān)系非常接近的序列分子[2]。在這種情況下，我們可以通過(guò)非標(biāo)記的阻斷探針來(lái)屏蔽非靶標(biāo)序列，減少標(biāo)記探針的錯(cuò)誤結(jié)合，從而提高其特異性。PNA阻斷探針有時(shí)和化學(xué)封閉物同時(shí)使用，以消除標(biāo)記探針與膜的非特異結(jié)合，提高特異性?？傊?，PNA阻斷探針僅與標(biāo)記探針有微弱的結(jié)合靶標(biāo)的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)。我們可以調(diào)整阻斷探針的濃度，不斷優(yōu)化雜交方案，從而使特異性達(dá)到最佳。

2 肽核酸探針技術(shù)在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1肽核酸探針技術(shù)應(yīng)用于乙型肝炎病毒檢測(cè) 有研究人員[3]根據(jù)從Genebank上下載的HBV基因組序列，用Alignment軟件進(jìn)行對(duì)比分析，選取HBV的保守序列，根據(jù)設(shè)計(jì)引物的一般原則，設(shè)計(jì)了擴(kuò)增產(chǎn)物，從Pro.mega公司購(gòu)買dNTP，自主生產(chǎn)Taq酶，乙型肝炎病毒PCR診斷試劑盒購(gòu)自安普利生物工程有限公司。分別進(jìn)行單堿基突變檢測(cè)和HBV DNA的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示無(wú)論用DNA作為探針還是用PNA作為探針檢測(cè)單堿基突變，都可根據(jù)雜交信號(hào)的比值得到正確的雜交結(jié)果。而PNA作為探針時(shí)對(duì)鹽濃度的要求更低，雜交信號(hào)更強(qiáng)，陰性、陽(yáng)性探信號(hào)強(qiáng)度的對(duì)比也更強(qiáng)烈；DNA做探針時(shí)為得到相對(duì)較好的結(jié)果，對(duì)洗脫條件的要求更苛刻。而檢測(cè)HBV DNA的結(jié)果顯示，用PNA探針檢測(cè)乙肝患者（大三陽(yáng)）血清16份，所得結(jié)果與使用乙型肝炎病毒PCR診斷試劑盒所得結(jié)果完全相同，其中有1例使用試劑盒確定為極弱的陽(yáng)性，但通過(guò)本方法檢測(cè)為明顯陽(yáng)性。肽核酸探針對(duì)核酸鏈間錯(cuò)配的強(qiáng)識(shí)別能力使得該技術(shù)在乙型肝炎病毒的檢測(cè)中發(fā)揮重大作用。

2.2肽核酸探針技術(shù)應(yīng)用于鼠疫耶爾森氏菌的檢測(cè) 鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis，以下簡(jiǎn)稱鼠疫菌）引起的，它是傳統(tǒng)生物戰(zhàn)劑之一，是恐怖分子用于制造生物恐怖的首選微生物之一，因此對(duì)該菌的快速檢測(cè)與鑒定具有重要意義。F1抗原是鼠疫菌中發(fā)現(xiàn)最早的抗原，也是該菌最重要的保護(hù)性抗原，因其具有非常高的特異性，c礬基因是Fl抗原的結(jié)構(gòu)基因，編碼Fl抗原的亞單位，讀碼結(jié)構(gòu)為510個(gè)核苷酸。

有實(shí)驗(yàn)[4，5]以鼠疫菌DNA作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行特異性試驗(yàn)，檢測(cè)了7種非鼠疫菌株，包括金黃色葡萄球菌、假結(jié)核耶爾森氏菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、枯草芽胞桿菌、類白喉棒狀桿菌、布魯氏菌，結(jié)果顯示只有陽(yáng)性對(duì)照鼠疫菌和傷寒沙門氏菌的信號(hào)高于空白對(duì)照，其他菌種對(duì)應(yīng)的信號(hào)均低于空白對(duì)照。出現(xiàn)此結(jié)果可能的原因是探針與磁珠或c筘顆粒結(jié)合的效率不可能達(dá)到100%，使部分顆粒表面缺少探針的覆蓋而產(chǎn)生非特異的結(jié)合，所以這種檢測(cè)方法的靈敏度和特異性較熒光定量PCR和常規(guī)PCR方法有一定的差距，但作為一種新技術(shù)，經(jīng)過(guò)改進(jìn)，且在研制專用單分子檢測(cè)儀器的基礎(chǔ)上，本方法有望成為不需要PCR擴(kuò)增、檢測(cè)靈敏度可與PCR媲美

2.3其他肽核酸探針技術(shù)在微生物檢測(cè)中應(yīng)用 目前，美國(guó)緬因州立大學(xué)的研究人員[6]采用有毒赤潮生物Alexandrium藻作為目標(biāo)藻。采用半自動(dòng)的三明治雜交方式，研究比較了雙標(biāo)記的PNA探針和相應(yīng)的雙標(biāo)記DNA探針及三標(biāo)記DNA探針的檢測(cè)效果，結(jié)果表明，PNA探針的檢測(cè)效果明顯高于DNA探針。此外，針對(duì)病原微生物的分子化石一rRNA的序列，設(shè)計(jì)PNA探針并使之與熒光原位雜交（FISH）技術(shù)相結(jié)合可有效用來(lái)分離、鑒定病原微生物。目前已經(jīng)有利用該技術(shù)從血培養(yǎng)的標(biāo)本中分離、鑒定出了金黃色葡萄球菌舊引的實(shí)驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]李可，張曉峰，王忠才，等.肽核酸探針在微生物診斷領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2012，39（7）：1000-1006.

[2]葉乃芳，王中新.16SrRNA及相關(guān)技術(shù)用于臨床細(xì)菌鑒定的研究進(jìn)展[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，4：520-522.

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[5]郭輝，王翠娥，彭剛，等.VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)在嚙齒類細(xì)菌學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2014，31（2）：16-19.

[6]張麗，徐英春.MALDI-TOF MS在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)感染與化療雜志，2013，13（3）：226-231.編輯/安樺