食源性諾如病毒疫情中PCR檢測技術的運用探討

摘要：目的 對1起由諾如病毒引起的學校聚集性急性胃腸炎疫情進行實驗室調查分析。方法 流行病學調查與實驗室檢測相結合，采集病例肛拭、糞便、食品、調味品、環(huán)境涂抹樣、水樣共40份樣本，進行RT-PCR核酸檢測及常規(guī)細菌學檢測。結果 6名學生、1名保健教師、3名食堂廚師的肛拭樣和1個糞便樣、1個食品中檢出諾如病毒核酸陽性。結論 RT-PCR檢測技術能快速有效的檢出肛拭、糞便、食物中的諾如病毒，從而為疫情的病因診斷提供科學依據。

關鍵詞：諾如病毒；PCR；食源性疾病；檢測技術

Abstract：Objective A laboratory investigation and analysis of school outbreaks of acute gastroenteritis caused by Norovirus was performed. Methods The method combined epidemiological investigation with laboratory testing was employed. A total of 40 samples including anal swabs and feces of patients； food； condiments； smear samples of environment samples ； water samples were collected and utilized for RT-PCR detection and routine bacteriological testing. Results Norovirus nucleic acid were detected positive in anal swabs of six students， a health care teacher， three chefs and a feces sample， a food. Conclusion Norovirus in anal swab， feces and food can be detected quickly and effectively by RT-PCR.

Key words：Norovirus；PCR；Foodborne diseases；Detection technology

近年來，諾如病毒引起的急性胃腸炎暴發(fā)時有發(fā)生。諾如病毒可通過食物、水及人與人接觸而使人感染發(fā)病，若在學校及幼兒園等集體單位發(fā)生，則易引起群體性胃腸炎暴發(fā)。諾如病毒感染性腹瀉以起病急、傳播快、暴發(fā)多為特征，因該病的癥狀及其多在冬季流行率上升，故被稱為\"胃腸道流感\(zhòng)"或\"冬季嘔吐病\"[1]。本文針對2015年3月成都市成華區(qū)某小學發(fā)生的一起諾如病毒引起的聚集性急性胃腸炎，將相關實驗室病原檢測情況及技術探討報告如下：

1 資料與方法

1.1臨床信息 學生聚集性病例的主要癥狀為嘔吐、腹瀉、腹痛、惡心，部分病例的血常規(guī)檢測結果顯示白細胞總數、中性粒細胞率增高。

1.2流行病學及衛(wèi)生學調查 患者均為在校學生及教師，有在校共同進餐史，學校提供公用直飲水及生活用水。

1.3 樣本采集及其來源 根據流行病學信息，準備的采樣物資包括病毒采樣管（北京友康）、自配滅菌1% NaCl肉湯、滅菌鹽水和腸道致病菌直劃平板（Mac、HE、TCBS）。采集病例肛拭8份、糞便樣1份、學校廚師肛拭8份、供餐食品留樣5份、調味品4份、環(huán)境涂抹樣16份及水樣2份（見表1）。

1.4實驗室檢測 對采集的樣本進行病毒學檢測和食物中毒常規(guī)致病菌檢測。用RT-PCR法檢測諾如病毒和輪狀病毒核酸；采用RT-PCR和細菌培養(yǎng)法檢測食物中毒常規(guī)致病菌：沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌、致瀉大腸埃希氏菌。

1.4.1 病毒檢測樣本處理 肛拭和糞便樣本無需前處理；對于食品樣本，采用無菌操作取適量（約5 g）樣本至病毒采樣管內（若有體積較大的食材，則用滅菌剪刀剪碎后放入），充分振搖后，靜置待用。

1.4.2 細菌DNA 的提取及檢測 取樣本鹽水管上清液1mL，12000rpm離心5min后棄上清。沉淀加入滅菌水50μL，將其懸浮后100℃煮沸5min，12000rpm離心2min，取上清用于PCR反應。本實驗采用達安生物科技有限公司提供的沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌、致瀉大腸埃希氏菌核酸檢測試劑盒，按說明書加入5μL核酸提取物，在ABi Step-one plus PCR擴增儀依程序進行40次循環(huán)擴增，并檢測。

1.4.3病毒RNA 的提取及檢測 選用天隆核酸提取試劑盒（磁珠法）（Ex-RNA/DNA 病毒2.0）提取病毒RNA。取各樣本上清液200μL，按說明書加入10μL Proteinase K，4μL Acryl Carrier，放入天隆NP 968核酸提取儀依程序自動提取。RT-PCR采用達安生物科技有限公司的A、B、C 組輪狀病毒核酸、諾如病毒核酸檢測試劑盒，取核酸提取物5μL，加入PCR反應管，放入ABi Step-one plus PCR擴增儀依程序擴增40個循環(huán)，并檢測。

1.4.4 細菌學培養(yǎng)法常規(guī)檢測 按照WS 271-2007、GB 4789-2010方法進行沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌、致瀉大腸埃希氏菌、變形桿菌、椰毒假單胞菌等病原菌的檢測。

2結果

2.1細菌PCR檢測 擴增曲線均無明顯指數增長期和平臺期，表明樣本中未檢出目標菌核酸。

2.2病毒RT-PCR檢測 RT-PCR結果表明，6名學生、1名保健教師、3名食堂廚師的肛拭樣本和1個糞便樣本、1個食品樣本（炒榨菜）中檢出諾如病毒；所有樣本中均未檢出輪狀病毒（見表2）。

注：打\"/\"號為該樣品未開展檢測此項檢測。

2.3細菌學培養(yǎng) 細菌學培養(yǎng)結果顯示，樣本均未檢出目標菌。

2.4疫情控制 臨床資料、流行病學調查資料和實驗室檢測結果顯示，從食品加工者、食品及用餐者檢測出諾如病毒，構成一條出清晰的傳播鏈。因此，此次疫情判定為諾如病毒引起的聚集性疫情，可能系諾如病毒污染學校供餐食品所致。明確診斷和進行疫情分析后，疾控中心繼續(xù)開展調查，指導并督促學校落實疫情控制措施，停止食用污染的食品，對相關區(qū)域進行了消毒，對帶病毒廚師調離食品加工崗位，繼續(xù)開展癥狀監(jiān)測、病例搜索等防控措施。對住院病例進行有針對性治療。截止疫情發(fā)生后第3d，住院病例相繼痊愈出院，未發(fā)現新發(fā)病例，疫情得到有效控制。

3 討論

3.1在17例病例的臨床檢驗結果中，有5例血常規(guī)檢測結果顯示中性粒細胞率增高，淋巴細胞率降低，部分患者白細胞總數增高。一般情況，接診醫(yī)院會做出胃腸道細菌型感染診斷，但檢測實驗室不應輕易排除對病毒的采樣、檢測。

3.2此次事件共采集了40個樣本，包括肛拭、糞便、食品、調味品、環(huán)境涂抹樣、水樣等不同的樣本類型，樣本容器包括病毒采樣管、1% NaCl肉湯采樣管、滅菌鹽水采樣管和Mac、HE、TCBS致病菌直劃平板?？茖W、適度、合理的采集樣本可提高病原微生物的檢出率。

3.3諾如病毒的檢測目前主要采用RT-PCR 技術，國內食品類檢測研究僅限于牡蠣等貝類樣本， 尚未見蔬菜、水果等其他食品的病毒檢測方法報道。另外，食品樣本一般體積大，病毒含量少，樣本處理、病毒富集是實驗室檢測的關鍵點，也是難點。一般采用有機絮凝沉淀法進行富集[3]。但無論是PEG沉淀法，還是Trizol抽提法，過程都比較繁瑣、用時長，加之多數基層疾控中心現階段并未配備相關設備和耗材，因此無法進行病毒富集。在此次檢測中，我們根據經驗判斷病毒含量可能比較大，所以采用均質后靜置，取上清液直接進行檢測，結果顯示多個樣本諾如病毒陽性。這表明在樣本數量足夠、污染病毒量大且成分單一的情況下，本方法對于突發(fā)公共衛(wèi)生事件的快速檢測有一定的可行性。

3.4 與常規(guī)培養(yǎng)方法相比，PCR技術用于病原微生物檢測具有靈敏、快速、檢出率高等優(yōu)勢。目前，該技術的應用越來越廣泛。此次采用PCR法檢出以諾如病毒為代表的腸道致瀉病毒，為聚集性胃腸炎的病因診斷提供了有力證據。

3.5對于基層疾控中心來說，病原微生物的富集、檢測等基礎設備設施的匱乏給檢測帶來了一定的難度，特別是中西部地區(qū)的基層疾控中心應加強檢測能力的建設。

參考文獻：

[1] GUREMONT E，BRASSARD J，HOUDE A，et al.Development of an extraction and concentration procedure and comparison of RT-PCR primer systems for the detection of hepatitis A virus and norovirus GII in green onions[J].J Virol Meth， 2006， 134（1-2）：130-135 .

[2] KOOPMANS M，DUIZER E.Food borne viruses：an emerging problem[J].Int J Food Microbiol，2004，90（1）：23-41.

[3] 周曉紅.食品中諾如病毒RT-PCR 檢測技術研究進展[J].國外醫(yī)學衛(wèi)生學分冊，2009，36（4）：234-238.

編輯/王海靜