破血化瘀、填精補髓法對實驗性腦出血大鼠血腫周圍腦組織GSK—3β信號通路的作用研究

摘要：目的 探討破血化瘀、填精補髓法對大鼠腦出血血腫周圍組織GSK-3β信號通路表達(dá)的影響。方法 應(yīng)用WISTAR大鼠復(fù)制腦出血大鼠模型，觀察破血填精法在改善腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損及大鼠血腫周圍組織GSK-3β信號通路表達(dá)情況。結(jié)果 與模型組相比，陽性藥和受試藥各組大鼠在給藥1d和3d后能明顯改善大鼠神經(jīng)系統(tǒng)體征，降低神經(jīng)功能缺損評分；在給藥第3、7、14d，與模型組比較，受試藥高劑量和中劑量均明顯增加了損傷腦區(qū)GSK-3β信號通路表達(dá)數(shù)量（P<0.05或P<0.01，P<0.05）。結(jié)論 破血填精法方劑能明顯改善腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損；其作用機制可能為調(diào)高腦出血血腫周圍損傷組織中GSK-3β信號通路表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：腦出血；GSK-3β；破血化瘀；填精補髓

Abstract：Objecttive To investigate the effect of decoction of Poxue and Tianjing on the expression of brain derived neurotrophic factor GSK-3βand its receptor to the perihematomal tissue in experimental ICH Rats.Methods Using WISTAR rats as the model rats of cerebral hemorrhage.It is designed to observe the effect of the behavioristic index that how the Decoction of Poxue and Tianjing could improve the neurological deficit of the rats.There is also a experiment which is designed to observe the protein expression of GSK-3β.Results Compared with the model control group，the positive drug group and the investigational drug groups rats'neurological signs are improved after 1 and 3 days'administration.At the third，the seventh and fourteenth day of administration，compared with the model group，high and medium-dose group damaged brain area GSK-3βquantity are clearly increased（P<0.05 or P<0.01，P<0.05）. Conclusion The experiment has proved that the intracerebral hemorrhage rats'neurological deficit has been evidently improved by the Poxue and Tianjing prescription.And it has been proved from the molecular level that the mechanism might be increasing the expression of GSK-3βto the perihematomal tissue in experimental ICH rats.

Key words：Intracerebral hemorrhage；GSK-3β；Poxue and Tianjing

近十年來對腦出血后腦損傷發(fā)生機制的認(rèn)識得到快速的發(fā)展。動物實驗研究已經(jīng)證實了作為出血結(jié)果的初期的機械性創(chuàng)傷、凝血衍生因子和腫塊效應(yīng)的作用。中醫(yī)藥治療腦出血的基礎(chǔ)實驗研究也在逐年開展，目前在促進血腫吸收，減輕腦水腫，提高實驗大鼠神經(jīng)功能評分方面得到了證實。同時中醫(yī)藥在減輕腦出血后自由基損傷、減輕炎性反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡也有大量的文獻報道。本研究力求從蛋白水平證明其作用機制，通過運用破血填精法中藥湯劑針對實驗性腦出血大鼠GSK-3β信號通路表達(dá)的影響。

1資料與方法

1.1一般資料 清潔級體重為250～300g Wistar大鼠，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實驗動物研究所提供，取雌雄各50%。破血化瘀、填精補髓法方劑：（瓜蔞20g、生蒲黃和石菖蒲各15g、生大黃10g、三七10g、龜板膠10g、水蛭8g、虻蟲5g），采用傳統(tǒng)煎藥方法，去渣之后取藥液進行濃縮，使1ml藥液中含1g生藥，4℃保存。醒腦健神膠囊（吉林省中醫(yī)院制劑室，批號：921116）。Western Blot全套系統(tǒng)采用美國Bio-Rad技術(shù)公司。鼠腦立體定位儀（STOELTING，America）；光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，Japan）；手持式牙科鉆（上海齒科器械）；生物組織包埋機BMJ-1（天津航空機電）；組織切片機RM2235（LEICA，germany）。

1.2方法

1.2.1實驗分組 取150只清潔級雌雄各半WISTAR大鼠，隨機分配為7組：其中正常對照組6只；陽性給藥對照組、模型組、受試高、中、低劑量藥物組、假手術(shù)組每組各24只；每組分別分為1d、3d、7d、14d四個時間點，其中每個時間點各6只。

1.2.2實驗大鼠模型制備 參照張朋奇[1]方法制備實驗性腦出血大鼠模型。用350mg/kg（體重）10%水合氯醛對實驗大鼠進行腹腔麻醉，于大鼠腹側(cè)尾根部1.5cm處縱行切開，游離鼠尾動脈，用微量進樣器抽取50ul未經(jīng)肝素化的尾動脈血液。大鼠腦立體定位儀調(diào)整好，大鼠俯臥位固定于立體定位儀上，使前囟、后囟位于同一水平面。沿大鼠頭部正中線切開皮膚暴露顱骨、冠狀縫和前囟。參照大鼠腦立體定位圖譜，將前囟作為0點，于0點右側(cè)旁開3.0 mm除，前0.4 mm處鉆孔至硬腦膜表面。帶有50ul動脈血的微量進樣器垂直刺入顱骨外表面下6.0mm處，以10μl/min的速度注入右側(cè)尾狀核，大約5min將動脈血全部注入。留針30min，緩慢出針1mm，繼續(xù)留針10min，然后緩慢將針完全取出，將鉆孔用骨臘封住。局部涂抹青霉素粉末并縫合切口。假手術(shù)組操作過程同上，但不向腦內(nèi)注入尾動脈血。

1.2.3給藥方法 正常對照組：自由飲水飲食；模型組和假手術(shù)組：采用1ml/100g生理鹽水灌胃，1次/d；高劑量藥物治療組：2ml/100g湯藥灌胃，1次/d；中劑量藥物治療組：1ml/100g湯藥灌胃，1次/d；低劑量藥物治療組：0.5ml/100g湯藥灌胃，1次/d。陽性對照組：醒腦健神膠囊30mg/100g劑量溶于2ml水灌胃，1次/d。

1.2.4大鼠腦神經(jīng)功能評分 使用Longa評分法對神經(jīng)功能進行評分，分為以下幾個等級：0分：無神經(jīng)功能缺損；1分：不能完全伸展左側(cè)前爪；2分：大鼠行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：大鼠行走時身體向左側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識出現(xiàn)喪失。

1.2.5 Western Blot檢測GSK-3β信號通路表達(dá) 大鼠經(jīng)水合氯醛腹腔注射麻醉后，打開胸腔，剝離出心臟，用止血鉗夾封閉胸主動脈和下腔靜脈，剪開右心耳，將靜脈留置針刺入大鼠左心室，用生理鹽水進行灌注，待流出清澈液體后，改灌注10%多聚甲醛，待頸部及上肢僵硬后，進行斷頭取腦，在經(jīng)DEPC處理的培養(yǎng)皿（放置在冰盤上）上分離右側(cè)腦組織，以之前注血的針孔處為中心取約100 mg腦組織，置于凍存管中，-80℃保存?zhèn)溆?。組織固定，Bio-Rad微型凝膠電泳，免疫印跡操作-轉(zhuǎn)膜，一抗與靶蛋白的結(jié)合，酶標(biāo)記二抗與一抗的結(jié)合，化學(xué)發(fā)光，最后在Quantity One軟件（Bio-Rad）下進行Western blot分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式表示，采用單因素方差分析方法，應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，對于不同組別之間采用LSD法進行兩兩比較。當(dāng)P<0.05時即認(rèn)為差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)系統(tǒng)體征及功能缺損評分與假手術(shù)組大鼠相比較，模型組的大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)功能病理體征；實驗組大鼠出現(xiàn)了左側(cè)肢體廢用的偏癱癥狀，并以前肢較為重，行走時呈順時針追尾狀。與模型組大鼠相比較，陽性給藥組和受試藥物各組大鼠在給藥1d和3d后上述癥狀均得到明顯改善，到第7d時基本恢復(fù)正常，見表1。

2.2 Western Blot檢測結(jié)果 在給藥7d后陽性藥組與模型組大鼠比較GSK-3β信號通路表達(dá)量略顯升高，但差異并不顯著（P>0.05）；中劑量和高級量受試藥物組大鼠GSK-3β信號通路表達(dá)量較模型組明顯增加（P<0.05，P<0.05）。而低劑量受試藥物組大鼠與模型組比較發(fā)現(xiàn)GSK-3β信號通路表達(dá)量沒有出現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）。

3討論

糖原合成激酶3β（Glycogen synthase kinase 3p，GSK-3β）是由活化的47-KDa絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶所構(gòu)成，早在20多年前，人們就己經(jīng)把它作為一種能降低糖原合成活性的激酶提純出來。在哺乳動物細(xì)胞中，GSK-3有兩種亞型，即51kDa的GSK-3α和47kDa的GSK-3β。它們的催化結(jié)構(gòu)域DNA序列具有高度的相似性，GSK-3α的活性由Tyr279和Ser21位點的磷酸化調(diào)節(jié)；而GSK-3β的活性則由Tyr216和Ser9位點的磷酸化來調(diào)節(jié)。但是Tyr279/216和Ser21/9位點在調(diào)節(jié)GSK-3功能上的作用是相反的，即Ser2I/9位點的磷酸化會下調(diào)GSK-3的活性，而Tyr279/216位點的磷酸化則會上調(diào)GSK 3的活性[2-4]。在這兩種GSK-3亞型中，GSK-3β在神經(jīng)系統(tǒng)中有特異性的表達(dá)。GSK-3是一種活性激酶，主要是通過抑制其活性來調(diào)節(jié)其功能的。通過對GSK-3β的Ser9位點進行磷酸化而抑制其活性，在缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護作用。相反，GSK-3β的Thr216位點磷酸化則會增加其活性，多見于神經(jīng)元變形的時候。GSK-3β是一種擁有40多個亞基的多功能激酶，它不僅能調(diào)控糖代謝，而且在細(xì)胞生長、增殖及死亡中也發(fā)揮了重要作用[5-8]。

實驗結(jié)果表明，各組實驗大鼠在腦出血后，通過破血化瘀、填精補髓法進行中藥干預(yù)，明顯改善了其神經(jīng)功能缺失損傷，高、中劑量受試藥物組中大鼠各種腦出血相關(guān)癥狀在3d后即可消失。破血填精法各組大鼠與模型組相比較，GSK-3β的表達(dá)量在第7d達(dá)到高峰，14d便可恢復(fù)到基本水平，且高劑量受試藥組在重復(fù)的單因素方差分析下效果最為顯著，并與給藥的劑量成正相關(guān)。

最終得知，通過對腦出血實驗大鼠的治療發(fā)現(xiàn)，運用破血化瘀，填精補髓法中藥湯劑方法可明顯減輕腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損的癥狀，是通過調(diào)節(jié)GSK-3β信號通路這一其內(nèi)在機制來顯著減輕腦神經(jīng)損傷，并促進神經(jīng)元細(xì)胞修復(fù)。

編輯/申磊