IL-1、IL-6、IL-10與卵巢過度刺激綜合征的相關(guān)性及靜脈注射免疫球蛋白對(duì)卵巢過度刺激大鼠的影響

吐松古·艾買爾 古再努爾·艾力尼牙孜 阿衣扎旦·玉麥 熱汗古麗·庫爾班 薄曉莉

（新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科中心，烏魯木齊 830001）

卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）是一種常見的醫(yī)源性卵巢刺激綜合征，通常發(fā)生在黃體期或妊娠早期［1］。隨著國家二胎政策的開放以及人類輔助生殖技術(shù)的快速發(fā)展，更多的人選擇去生育第二胎，但是由于年齡因素和出生缺陷風(fēng)險(xiǎn)讓人們更多選擇輔助生殖技術(shù)幫助其獲得后代，而在其過程中為了獲得足夠數(shù)量的卵母細(xì)胞和胚胎，需要進(jìn)行降調(diào)以及促排卵，因此會(huì)導(dǎo)致OHSS的風(fēng)險(xiǎn)增加，因?yàn)镺HSS的病因復(fù)雜，許多方面尚未清楚［2］。

炎癥細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、IL-10或腫瘤壞死因子α（TNF-α）可能在OHSS發(fā)病機(jī)制中起著重要作用［3］。靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）具有抗細(xì)胞炎癥因子的作用，并能抑制各種細(xì)胞炎癥因子的分泌［4］。有研究報(bào)道IVIG可阻止OHSS的發(fā)生，阻斷免疫反應(yīng)，有助于免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。因此，本研究旨在探討炎癥細(xì)胞因子（IL-1、IL-6、IL-10）對(duì)OHSS病理生理的可能作用以及IVIG對(duì)OHSS大鼠模型的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，23～26日齡、體重65.0～75.0 g的未成年雌性大鼠（Wistar），所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在飼養(yǎng)中心進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨后在光暗交替（12 h）環(huán)境中飼養(yǎng)（光照7：00～19：00），飼養(yǎng)期間自由飲水和自由飲食。IL-1、IL-6、IL-10、ELISA試劑盒購自伊萊瑞特生物科技有限公司；TRNzol Universal總RNA提取試劑購自天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（M-MLV Reverse Transcriptase）購自Invitrogen公司；AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒購自諾唯贊科技有限公司；小型臺(tái)式冷凍型離心機(jī)（5417R）購自Eppendorf公司；電泳儀（Model 300V）購自LABNET公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Mx3005P）購自Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠OHSS模型的建立 根據(jù)改良的UJIOKA方法在每只大鼠皮下注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）10 U，每日1次，連續(xù)4 d，在第5天皮下注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）100 U 1次，經(jīng)過48 h后，卵巢顯著增大、表面紫褐色、大量卵泡形成，說明OHSS模型建立成功［5-6］。

1.2.2 動(dòng)物分組 將39只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組，每組13只。OHSS組：于周一下午4：00皮下注射10 U孕馬血清促性腺激素（PMSG，0.5 ml 0.9%生理鹽水），持續(xù)不間斷皮下注射4 d，在第5天下午4：00皮下注射100 U人絨毛膜促性腺激素（HCG，0.5 ml 0.9%生理鹽水）；IVIG組：于周一下午4：00皮下注射10 U孕馬血清促性腺激素（PMSG，0.5 ml 0.9%生理鹽水），隨后腹腔注射IVIG 100 mg（2 ml 0.9%生理鹽水），連續(xù)4 d，在第5天下午4：00腹腔注射100 U人絨毛膜促性腺激素（HCG，0.5 ml 0.9%生理鹽水）；對(duì)照組：連續(xù)5 d皮下注射等量0.5 ml 0.9%生理鹽水。

1.2.3 腹水EB濃度 注射HCG 48 h后，各組大鼠經(jīng)尾靜脈注射1%伊文思藍(lán)染料溶液（EB）0.05 ml/10 g，30 min后取血樣，隨后腹腔內(nèi)注入5 ml 0.9%生理鹽水灌洗腹腔，并用試管收集灌洗液，用分光光度計(jì)測定620 nm處的A值。測定標(biāo)準(zhǔn)液光吸收度，并制定標(biāo)準(zhǔn)曲線后得回歸方程，計(jì)算腹水EB濃度。

1.2.4 卵巢中EB含量 在腹腔灌洗結(jié)束后立即取出實(shí)驗(yàn)大鼠兩側(cè)的卵巢并稱重。將右側(cè)卵巢置于4 ml 65℃甲酰胺（N，N-二甲基甲酰胺）中孵育24 h后，用分光光度計(jì)測定620 nm處的A值，測定標(biāo)準(zhǔn)液A值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算卵巢中EB含量，用以評(píng)估實(shí)驗(yàn)大鼠卵巢血管的通透性。

1.2.5 血和卵巢組織中IL-1、IL-6、IL-10的測定大鼠HCG注射后48 h后，使用水合氯醛麻醉后將各組大鼠眼球摘除進(jìn)行取血，2 000 r/min離心15 min后取上清液分裝，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測定大鼠血清，左卵巢使用RT-PCR的方法測定大鼠卵巢中IL-1、IL-6、IL-10的表達(dá)水平（引物特征見表1）。

表1 IL-1、IL-6、IL-10和GAPDH引物的特征Tab.1 Characteristics of IL-1，IL-6，IL-10 and GAPDH primers

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR使用Trizol試劑從卵巢組織中提取總RNA，取RNA樣品溶液1μl，利用Thermo Scientific公司的Nano Drop2000分光光度計(jì)檢測樣品在260 nm/280 nm處的吸光度，并計(jì)算總RNA濃度以及OD260與OD280的比值。所有RNA樣品的OD260/OD280比值為1.8～2.0（比率＜1.8意味著低純度，＞2.0的比率表示RNA的降解），進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。隨后用PrimeScript RT試劑盒通過逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）獲得cDNA，反應(yīng)條件為37℃，30 min；65℃，10 min；42℃，60 min；70℃，5 min。用QuantStudioTMReal-Time PCR Software儀進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（Real-Time PCR）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)以±s表示，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠卵巢總重量、卵巢EB濃度和腹腔沖洗液EB濃度 在最后一次注射后48 h出現(xiàn)過度刺激癥狀，OHSS組和IVIG組的卵巢均含有大量濾泡性、出血性囊腫和黃體，OHSS組卵巢重量顯著高于IVIG組和對(duì)照組（P＜0.05），IVIG組明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），OHSS組卵巢EB濃度顯著高于IVIG組和對(duì)照組（P＜0.05），但I(xiàn)VIG組與對(duì)照組無顯著性差異，OHSS組腹腔灌洗液EB濃度高于IVIG組和對(duì)照組，但3組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），OHSS組大鼠血清中VEGF含量顯著高于對(duì)照組，IVIG組中VEGF含量顯著低于OHSS組（P＞0.05），見表2。

表2 卵巢總重量、卵巢EB濃度和腹腔沖洗液EB濃度（±s）Tab.2 Total ovarian weight，ovarian EB concentration and abdominal flushing fluid EB concentration（±s）

表2 卵巢總重量、卵巢EB濃度和腹腔沖洗液EB濃度（±s）Tab.2 Total ovarian weight，ovarian EB concentration and abdominal flushing fluid EB concentration（±s）

Groups Control OHSS IVIG Total ovarian weight（mg）61.7±15.1 385.1±69.81）329.3±45.81）2）Peritoneal EB（mg/ml）1.26±0.93 1.56±1.13 1.33±0.63 Ovarian EB（mg/ml）0.08±0.012）0.10±0.03 0.08±0.022）VEGF（mg/ml）672.35±14.26 856.13±21.531）725.86±18.432）

2.2 各組大鼠血清中IL-1、IL-6和IL-10含量OHSS組大鼠血清中IL-1含量顯著高于正常對(duì)照組大鼠（P＜0.05），而IL-6和IL-10的含量相比于正常對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），皮下注射免疫球蛋白后，IVIG組的大鼠IL-1含量相比于HOSS組的大鼠顯著下降，IL-6和IL-10在大鼠血清中的含量升高（表3）。

表3 各組大鼠血清中IL-1、IL-6和IL-10含量（±s，pg/ml）Tab.3 Contents of IL-1，IL-6 and IL-10 in serum of rats in each group（±s，pg/ml）

表3 各組大鼠血清中IL-1、IL-6和IL-10含量（±s，pg/ml）Tab.3 Contents of IL-1，IL-6 and IL-10 in serum of rats in each group（±s，pg/ml）

Note：Compared with the control group，1）P＜0.05.

Groups Control OHSS IVIG Serum IL-1 286.24±17.45 476.45±28.491）341.25±18.521）Serum IL-6 489.36±26.48 298.42±34.151）397.62±24.521）Serum IL-10 415.62±21.76 283.72±26.791）376.11±34.421）

2.3 卵巢組織中IL-1、IL-6和IL-10的表達(dá)水平HOSS組大鼠卵巢組織中IL-1的表達(dá)水平相比于正常對(duì)照組顯著升高，而IL-6和IL-10的表達(dá)水平相比于正常對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），但注射免疫球蛋白后，IVIG組大鼠卵巢組織中IL-1的表達(dá)水平相比于OHSS組明顯下降，IL-6和IL-10的表達(dá)水平相比于OHSS組明顯上升（P＜0.05）。說明靜脈注射免疫球蛋白產(chǎn)生了顯著效果（圖1、表4）。

表4 各組卵巢組織中IL-1、IL-6和IL-10的表達(dá)水平（±s）Tab.4 Expression levels of IL-1，IL-6 and IL-10 in ovarian tissues of each group（±s）

表4 各組卵巢組織中IL-1、IL-6和IL-10的表達(dá)水平（±s）Tab.4 Expression levels of IL-1，IL-6 and IL-10 in ovarian tissues of each group（±s）

Note：Compared with the control group，1）P＜0.05；compared with the OHSS group，2）P＜0.05.

Groups Control OHSS IVIG Ovarian IL-1 109.33±29.74 204.64±58.241）215.24±39.931）Ovarian IL-6 315.62±29.76 223.72±24.791）287.13±25.421）Ovarian IL-10 338.44±39.78 260.66±35.541）304.16±47.911）2）

圖1 樣品的溶解曲線以及擴(kuò)增曲線Fig.1 Dissolution curve and amplification curve of sample

3 討論

UJIOKA等［5］首次在未成年兔身上建立了OHSS的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并利用未成年雌性大鼠產(chǎn)生過度刺激的表現(xiàn)。國內(nèi)研究報(bào)道付永倫等［6］對(duì)UJIOKA等［5］的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行改良，本研究建立的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮诟队纻悓?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷幕A(chǔ)上稍加改良，建立了OHSS的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。OHSS大鼠卵巢明顯增大，毛細(xì)血管通透性增加，尤其是卵巢局部毛細(xì)血管通透性增加。卵巢過度刺激綜合征是卵巢刺激的嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)危及生命，近年來大量研究結(jié)果顯示白介素、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等細(xì)胞因子可能在OHSS發(fā)病中發(fā)揮炎性介質(zhì)的作用從而引起全身毛細(xì)血管通透性增加，進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體體液外滲，從而造成復(fù)雜的卵巢過度刺激綜合征［6］。然而細(xì)胞炎癥因子在卵巢過度刺激綜合征病理生理中的作用尚不清楚，最近研究表明，炎癥細(xì)胞因子與血管高滲透的演變之間可能存在關(guān)聯(lián)，卵巢局部毛細(xì)血管通透性增加是卵巢過度刺激綜合征的一個(gè)主要特征［7］。徐少元等［8］報(bào)道稱，在接受IVF-ET取卵的婦女中，卵泡內(nèi)細(xì)胞因子濃度升高，最終發(fā)展為OHSS。

ENGMANN等［9］觀察到OHSS患者血漿和腹水中IL-6濃度較高。ATSUSHI等［10］報(bào)道了嚴(yán)重OHSS患者腹水和血漿中有高濃度的細(xì)胞因子，OHSS患者血清和卵泡液中VEGF、IL-6和IL-2的存在，這些結(jié)果提示炎癥細(xì)胞因子與卵巢過度刺激綜合征的病理生理學(xué)密切相關(guān)。DARII等［11］研究發(fā)現(xiàn)取卵日卵泡液中的IL-6濃度可作為卵巢過度刺激綜合征高危者早期發(fā)展的預(yù)測因子，在取卵當(dāng)天，高危患者發(fā)生OHSS的血清和卵泡VEGF值均高于對(duì)照組（P＜0.05），血清和卵泡液中IL-2水平在兩組間無差異。SHAM等［12］發(fā)現(xiàn)OHSS患者的外周血IL-10水平在促性腺激素注射時(shí)顯著低于對(duì)照組，并與卵泡數(shù)呈負(fù)相關(guān)，在OHSS發(fā)展過程中逐漸升高，提示OHSS患者可能有IL-10低下的病理基礎(chǔ)。SANTOSL等［13］發(fā)現(xiàn)卵泡液中IL-18水平與取卵數(shù)呈正相關(guān)，OHSS患者取卵日血清IL-18平均水平顯著高于對(duì)照組。ENSKOG等［14］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)OHSS患者IL-18顯著升高，隨癥狀改善而下降，并與血管通透性和IL-6水平相關(guān)。IL-1、IL-6均由多種細(xì)胞合成和分泌，具有免疫調(diào)節(jié)、急性期反應(yīng)的作用，并參與機(jī)體炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)OHSS大鼠血、卵巢IL-1均顯著升高，提示在卵巢過度刺激綜合征發(fā)病早期，由IL-1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和炎癥反應(yīng)在OHSS大鼠體內(nèi)可能起主要作用，且引起全身反應(yīng)。IL-10具有抗炎作用，OHSS大鼠卵巢IL-10較對(duì)照組顯著降低，結(jié)合卵巢IL-1、IL-6的變化進(jìn)一步表明卵巢是局部反應(yīng)的主要場所；并且由于IL-10的降低減輕了對(duì)卵巢局部炎癥反應(yīng)抑制，加劇了OHSS大鼠的局部癥狀。

IVIG最初被用作免疫缺陷疾病的替代療法，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于許多自身免疫性和炎癥性疾病。例如，IVIG是一種治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的有效方法，IVIG成功治療后發(fā)生植入失敗的患者［14］。此外，IVIG對(duì)于植入失敗患者有較高的療效。MAKATSUKA等［15］報(bào)道IVIG可識(shí)別BAFF（腫瘤壞死因子家族的B細(xì)胞激活因子）和APRIL（增殖誘導(dǎo)配體）并且阻止BAFF對(duì)B細(xì)胞發(fā)揮抗凋亡作用。IVIG可預(yù)防BAFF在B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病中的不良作用，IVIG似乎是一種安全的治療方法。大多數(shù)患者沒有不良反應(yīng)或只有輕微的不良反應(yīng)［16］。IVIG的作用機(jī)制比較復(fù)雜，包括調(diào)控Fc受體的表達(dá)和功能，IVIG還會(huì)干擾補(bǔ)體及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，進(jìn)一步通過影響T細(xì)胞和B細(xì)胞從而激活樹突狀細(xì)胞的效應(yīng)功能［17-18］。

有研究提出了通過靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）來改變有OHSS風(fēng)險(xiǎn)婦女的免疫內(nèi)穩(wěn)態(tài)性，目的是防止OHSS對(duì)超生理性卵巢刺激的異常免疫反應(yīng)［19］。在OHSS兔模型中，IVIG預(yù)處理可降低腹水反應(yīng)與牛血清白蛋白水平，影響卵巢重量和血清雌二醇和孕酮水平。

本研究中，IVIG通過降低卵巢重量和IL-10水平來防止卵巢局部毛細(xì)血管通透性增加，由此看來靜脈注射IVIG可能有助于預(yù)防OHSS，但提供的保護(hù)機(jī)制并不完全，為了闡明白細(xì)胞介素和IVIG在OHSS的病理生理學(xué)和預(yù)防中的作用，尚需進(jìn)一步對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入探討。