五種裂腹魚亞科魚類外胚層發(fā)育不良因子A受體基因Edar的克隆和序列分析

郭新異 謝玲 張濟(jì)澤 冀銀 龐礴 郭松長

摘要：裂腹魚亞科魚類具有豐富的體表附屬器官變異，而Edar是控制這類結(jié)構(gòu)發(fā)育的關(guān)鍵基因。以5種裂腹魚的代表物種為材料克隆其Edar基因的編碼區(qū)片段，序列分析表明：該基因編碼的蛋白在裂腹魚中存在長度不同的組氨酸重復(fù)序列，串聯(lián)組氨酸插入可能與蛋白定位有關(guān)；基因樹支持裂腹魚與金線鲃具有最近的親緣關(guān)系；分子進(jìn)化分析未檢測到正選擇信號(hào)，裂腹魚基因的低復(fù)雜區(qū)可能是受選擇區(qū)域以上結(jié)果說明裂腹魚Edar基因的結(jié)構(gòu)變異可能與裂腹魚表型變異和演化有關(guān)。

關(guān)鍵詞：裂腹魚亞科；體表附屬器官；基因克?。恍蛄蟹治?/p>

中圖分類號(hào)：Q951 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-7847（2015）01-0049-05

CloningandSequenceAnalysisofEctodysplasin-AReceptorGeneEdarinFiveSchizothoracineFishes

GUOXin-yi12，XIELing1ZHANGXu-ze3，JIYin-fa1，PANGBo1，2，GUOSong-chang1*

（1.KeyLaboratoryofAdaptationandEvolutionofPlateauBiota，NorthwestInstituteofPlateauBiology，ChineseAcademyofSciences，Xining810008，Qinghai，China；2.UniversityofChineseAcademyofSciences，Beijing100049，China；3.QinghaiUniversityforNationalities，Xining810007，Qinghai，China）

Abstract：Schizothoracinesubfamilyfishesarerichinvariationsofskinappendages.TheEdargeneplaysavitalroleinthedevelopmentofthesestructures.ThecodingregionsegmentsofEdargenewereobtainedfromfiverepresentativeSchizothoracinespecies.Histidinerepeatsofdifferentlengthswerefoundinthepro?teinsequencesofthisgeneinSchizothoracine.Tandemhistidineinsertsmightaccountforthelocalizationoftheprotein.ThegenetreeshowedthatSchizothoracinefishesclusteredwiththegolden-linefish.Signalsofpositiveselectionwerenotdetectedinourmolecularevolutionanalysis；whilethelowcomplextityregionofthisgenemightbethetargetforselection.IlisconcludedfromtheaboveresultsthatthestructuralmutationsinSchizothoracineEdargenemightl）erelatedtothephenotypicvariationandevolutioninthesespecies.

Keywords：Schizothoracine；skinappendages；genecloning；sequenceanalysis

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：049?053）

脊椎動(dòng)物體表附屬器官的變異一直是進(jìn)化和發(fā)育生物學(xué)家關(guān)注的問題。早在1875年，達(dá)爾文在《動(dòng)物和植物在家養(yǎng)下的變異》一書中指出，毛發(fā)、羽毛、蹄、角以及牙齒等體表附屬器官具有共同起源，并描述了一戶印度家庭四代人少汗和毛發(fā)牙齒等發(fā)育缺陷的男性遺傳疾病[1]。這種疾病后來被稱為止汗或少汗型外胚層發(fā)育不良癥（anhidrotic/hypohidroticectodermaldysplasia，HED/E-DA）。HED具有兩大鮮明特征，一是同時(shí)影響多個(gè)外胚層發(fā)育而來的器官，二是受影響的人群主要為男性[2]。引起HED的基因主要有4種[3]：外胚層發(fā)育不良因子A（Ectodysplasin-A，Eda）、Eda受體（Ectodysplasin-Areceptor，Edar）、Eda受體相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域（Edarassociateddeathdomain，Edaradd）和Wnt基因家族成員中的研究表明，EDA信號(hào)通路非常保守，上述基因的突變不僅在狗、牛、大鼠、小鼠和人等哺乳動(dòng)物中造成相似的外胚層發(fā)育不良表型，在雞、斑馬魚和青魚將等其他脊椎動(dòng)物中也同樣影響外胚層衍生的體表附屬器官發(fā)育[2、4-7]。

裂腹魚亞科（Schizothoracine）是鯉形目鯉科魚類的一個(gè)分支，因肛門和臀鰭基部兩側(cè)擴(kuò)大的臀鱗狀似腹部有裂縫而得名。該亞科廣泛分布于青藏高原及其毗鄰地區(qū)，包含11～12屬共100多種[8]。研究表明，在適應(yīng)高原環(huán)境的過程中，裂腹魚亞科魚類的形態(tài)具有三大演化趨勢：體鱗趨于退化、下咽齒行數(shù)趨于減少、觸須趨于消失[9]。值得注意的是，裂腹魚類群中這些發(fā)生變異的結(jié)構(gòu)，均為外胚層衍生的附屬器官。已經(jīng)證明，在模式動(dòng)物斑馬魚和青魚中，Edar/Eda的突變會(huì)影響個(gè)體鱗片、鰭條和咽齒等結(jié)構(gòu)的發(fā)育，且個(gè)體能存活到成體并具有可育性[6、7、10]。然而這些研究均為人工突變體篩選得到的結(jié)果，自然選擇是否會(huì)通過這些基因來促進(jìn)物種演化還不得而知。

研究EDA信號(hào)通路在裂腹魚亞科魚類表型變異中的作用，有助于在分子水平理解自然選擇下體表附屬器官的變異機(jī)制以及生物的適應(yīng)性演化本研究首次對(duì)裂腹魚亞科魚類的Edar基因進(jìn)行了克隆和序列分析，為揭示基因在裂腹魚亞科魚類表型變異中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法1.1材料

1.1.1動(dòng)物樣品的采集

青海湖裸趣（Gymnocyprisprzewalskii）米集于青海省剛察縣泉吉鄉(xiāng)。由于青海湖裸鯉為國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，經(jīng)當(dāng)?shù)赜嘘P(guān)部門批準(zhǔn)，采用粘網(wǎng)捕獲少量個(gè)體。異齒弓魚（Schizothoraxooconnori）、雙須葉須魚（Ptychobarbusdipogon）和尖裸鯉（Oxy-gymnocyprisstewardi）購自西藏自治區(qū)拉薩市布達(dá)拉宮西魚市。高原裸裂尻魚（Schizopygopsisstoliczkcw）采集于西藏自治區(qū)日土縣，采用粘網(wǎng)捕獲。實(shí)驗(yàn)用魚就地解剖并迅速將組織放入液氮中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于-80℃冰箱保存。

1.1.2主要試劑

RNAVzol試劑盒購于北京威格拉斯生物技術(shù)公司，pGEM-Teasy載體購自Promega公司（美國），反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Thermo公司（美國），PCR所需10xBuffer、dNTP和ExTaq聚合酶購自大連寶生物公司，感受態(tài)DH5a購自北京全式金生物公司，DNA凝膠純化試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，其它生化試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2方法

1.2.1總RNA提取與第一鏈cDNA的合成

RNA提取采用RNAVzol試劑盒，參照說明書執(zhí)行。每個(gè)物種選取一個(gè)個(gè)體，取100mg側(cè)線上方白肌組織置于加入了預(yù)冷RNAVzol試劑的組織研磨器中，冰上迅速研磨至勻漿，裂解充分后經(jīng)氯仿抽提、異丙醇沉淀和乙醇洗滌等步驟獲得RNA沉淀。干燥的RNA沉淀以0.1%DEPC處理水溶解，利用Narwdrop2000紫外分光光度計(jì)測定值以確定純度，并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳大致判斷其完整性。第一鏈cDNA合成利用Thermo Scientific RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行。

1.2.2引物設(shè)計(jì)

從GenBank獲取人（Homosapiens，NM_0223-36.3）、斑馬魚（Dowiorerio，NM_001115064.1）、青鳉（Oryziaslatipes，NM_001104759.1）的EdarmRNA序列，用PrimerPremier6（PremierBiosoft，USA）軟件在其高度保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)引物，并利用NCB1的在線工具Primer-BLAST在斑馬魚RefseqmR-NA數(shù)據(jù)庫中檢查引物特異性。最終設(shè)計(jì)的引物序列為ER-F：5'-ATCGCCATGTCAACCATCTTC-ATC-3'和ER-R：5'-CGTCTTCACCACCGCCTT-ATCA-3'。

1.2.3cDNA克隆

以上述cDNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增5種裂腹魚CDS片段。反應(yīng)體系為50μL，其中cDNA（濃度約200ng/μL）2μL，包含10xBuffer5μL，dNTP（濃度為2.μmol/L）2.5μL，上下游引物（濃度為10μmol/L）各2μL，ExTaq聚合酶（5U/μL）0.5μL，加入ddH2O補(bǔ)足體積。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，57°C退火40s，72℃延伸50s，共38個(gè)循環(huán)，最后在72℃下延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，通過凝膠回收試劑盒回收目的片段，連接至pGEM-Teasy載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐青霉素抗性篩選得到陽性克隆，其中每個(gè)平板挑取的克隆數(shù)目不少于3個(gè)。采用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后送上海生工生物公司，利用M13引物進(jìn)行雙向測序，若發(fā)現(xiàn)不同克隆的測序結(jié)果不一致，則增加測序的克隆數(shù)目。

1.2.4序列比對(duì)與基因樹的構(gòu)建

測序結(jié)果通過BLAST確定是否為目標(biāo)序列，同時(shí)從GenBank下載其他硬骨魚Edar基因序列，納入分析的物種包括：秀美花鳉（poeclia for-mosa，XM_007557129.1）、三刺魚（Masterosteusaculeatus，DQ985077.1）、白斑狗魚（Esoxlucius，GATF01013030.1）、鉗魚（Ictaluruspunctatus，JT414449.1）和狹孔金線鲃（Sinocyclocheilusan-gustiporus，GAHOO1128845.1）。利用MEGA5軟件[11]對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)和人工處理，并利用DNAMAN軟件生成氨基酸比對(duì)結(jié)果。通過jModelTest2.1.1軟件[12]基于赤池信息準(zhǔn)則（Akaikeinformationcri-teri0n，AIC）選擇最佳的核酸替代模型，進(jìn)而構(gòu)建最大似然樹和貝葉斯樹。最大似然樹的構(gòu)建采用PAUP4.0b10[13]及PaupUp圖形化界面，通過啟發(fā)式搜索算法進(jìn)行1000次重復(fù)（方式為random-addition-sequence），Bootstrap進(jìn)行1000次重復(fù)以獲得支持度。貝葉斯樹的構(gòu)建采用MrBayes3.2.1軟件[14]，兩組重復(fù)同時(shí)進(jìn)行，每組4條Metropo-lis-coupledMarkovchains（3條熱鏈和1條冷鏈），運(yùn)行10000000代MonteCarlo，取樣頻率為每1000代，舍棄前50%樣本，進(jìn)而利用剩下的5002棵樣本樹生成50% majority-rule一致性樹。

1.2.5分子進(jìn)化分析

采用PAML4.7a軟件包[15]中的codeml程序?qū)α迅刽~Edar基因進(jìn)行分支模型、位點(diǎn)模型和分支位點(diǎn)模型分析。因裂腹魚屬（Schizothorax）最為原始，在分析時(shí)將裂腹魚支系和除裂腹魚屬的異齒弓魚外的其他裂腹魚支系分別作為前景支，其他物種作為背景支。所有嵌套模型均采用似然比檢驗(yàn)法（LRT），利用卡方檢驗(yàn)判斷兩模型間的似然函數(shù)對(duì)數(shù)值（InL，l）的差異（2□l）是否顯著。

2結(jié)果

2.1測序結(jié)果和序列比對(duì)

本實(shí)驗(yàn)獲得5種裂腹魚的Edar基因CDS片段長度為585～612bp，其中青海湖裸鯉的序列最長（612bP），異齒弓魚的序列最短（585bp）。翻譯成氨基酸后，本研究獲得的序列對(duì)應(yīng)EDAR蛋內(nèi)的跨膜區(qū)和死亡結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域，與斑馬魚相比，裂腹魚的序列中具有不同程度的插入缺失（圖1）。此外，該基因在異齒弓魚、雙須葉須魚和高原裸裂尻魚分別存在兩種單倍型（見表1，分別編號(hào)為1和2）。值得注意的是，與其他幾種硬骨魚相比，裂腹魚類在該蛋白的一處低復(fù)雜區(qū)域存在不同長度的組氨酸（His，H）插入，其中異齒弓魚無插入，雙須葉須魚插入1或3個(gè)，其他裂腹魚類插入3-5個(gè)。

2.2基因樹的構(gòu)建

基于獲得的序列聯(lián)合其他已知的硬骨魚Edar序列，進(jìn)行最大似然方法和貝葉斯方法的基因樹構(gòu)建，結(jié)果顯示兩種方法得到的基因樹結(jié)構(gòu)一致（圖2），且節(jié)點(diǎn)處的貝葉斯后驗(yàn)概率（bayesianposteriorprobability，BPP）及基于最大似然法的bootstrap值（BP）也較為一致其中鯉形目的斑馬魚、狹孔金線鲃、裂腹魚類聚為一支（BPP=91，BP=65），青鳉、秀美花鳉、三刺魚和白斑狗魚聚為一支（BPP=100 BP=100），鉗魚單獨(dú)為一支。這一結(jié)果顯示裂腹魚類與金線鲃具有較近的親緣關(guān)系。值得注意的是，裂腹魚的特化類群形成一個(gè)支持度較高的多岐分支（BPP=100，BP=92），而該分支內(nèi)部的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系卻不能得到解析。

2.3分子進(jìn)化分析

利用PAML軟件進(jìn)行的分子進(jìn)化分析結(jié)果見表2。分支模型分析顯示，不論是否將異齒弓魚納入前景支進(jìn)行分析，似然比檢驗(yàn)的結(jié)果均不支持裂腹魚支系的氨基酸非同義/同義替換比率（dN/ds，w）發(fā)生顯著變化（P>0.05）。同時(shí)，分支位點(diǎn)模型分析的結(jié)果也不支持裂腹魚支系存在正選擇位點(diǎn)（P>0.05）。在位點(diǎn)模型分析中，M3與M0模型的比較顯示該基因不同位點(diǎn)的氨基酸替換比率在物種間具有異質(zhì)性（P=0），而M8和M7模型以及M2和M1模型的LRT檢驗(yàn)均不支持Edar基因在硬骨魚中存在正選擇位點(diǎn)（

0.05）.

3討論

本實(shí)驗(yàn)克隆了5種裂腹魚亞科魚類的Edar基因CDS片段，并將其編碼的氨基酸序列與其他硬骨魚的該基因氨基酸序列進(jìn)行了分子進(jìn)化分析。Edar基因?yàn)槟[瘤壞死因子受體（tumornecro?sisfactorreceptor，TNFR）超家族的一員，其編碼的EDAR蛋白為分泌型的跨膜蛋白，包含信號(hào)肽序列、TNFR位點(diǎn)、跨膜區(qū)、低復(fù)雜區(qū)域和死亡結(jié)構(gòu)域[2、16]。研究表明Edar的5UTR和3UTR區(qū)域在不同物種間差異較大，其信號(hào)肽序列的同源性也不高，且跨膜區(qū)兩端的低復(fù)雜區(qū)域也具有較大變異，說明該基因發(fā)揮生物學(xué)作用的途徑可能具有物種特異性[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，裂腹魚EDAR蛋白的低復(fù)雜區(qū)域存在不同數(shù)目的組氨酸插入。已有研究表明，蛋白序列中的串聯(lián)組氨酸插入可能影響分泌型蛋白的靶向部位，從而改變蛋白的生物學(xué)效應(yīng)[17]。此外，裂腹魚中的組氨酸插入呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，即具有不同插入缺失數(shù)目的物種正好可以對(duì)應(yīng)曹文宣等[9]劃分的裂腹魚的3個(gè)等級(jí)。然而，在青海湖裸鯉和尖裸鯉中我們沒有檢測到其他單倍型，這可能是由于測序的克隆數(shù)目不夠。此外，利用Edar片段構(gòu)建的基因樹并不能很好地反映裂腹魚的進(jìn)化關(guān)系，這可能是由于該片段為核基因CDS片段，積累的變異較少，因此無法準(zhǔn)確反映較低階元的物種發(fā)生關(guān)系。另外，本試驗(yàn)的分子進(jìn)化分析并沒有提供Edar基因發(fā)生正選擇的證據(jù)，這可能是因?yàn)樵摶蛩茏匀贿x擇正是發(fā)生在上述發(fā)生插入事件的低復(fù)雜區(qū)域，而PAML軟件無法對(duì)插入缺失的信息進(jìn)行很好的處理[15]。

影響生物表型變異與演化的因素有很多，研究人員基于基因序列上的變化提出了兩種假說，即支持變異與演化由基因調(diào)控區(qū)域主導(dǎo)的“調(diào)控變異”（regulatorymutation）假說和支持由編碼區(qū)變異主導(dǎo)的“結(jié)構(gòu)變異”（structuralmutation）假說[18]。在本研究中，裂腹魚Edar基因在編碼序列中存在結(jié)構(gòu)變異，即氨基酸序列的變異和插入缺失。鑒于該基因在外胚層衍生的體表附屬器官發(fā)育中的重要作用，我們推測這些結(jié)構(gòu)變異與裂腹魚相應(yīng)結(jié)構(gòu)的演化存在密切聯(lián)系，有必要在今后的工作中對(duì)裂腹魚亞科魚類Edar基因的表達(dá)調(diào)控及該信號(hào)通路上的其他基因如Eda、Edaradd等進(jìn)行研究。

[1]DARWIN C. The variation of animals and plants under domestication[M]. London： John Murray， 1868.

[2]SADIER A， VIRIOT L， PANTALACCI S， et al. The ectodys- plasin pathway： from diseases to adaptations[J]. Trends in Ge?netics， 2014， 30（1）：24-31.

[3]CLUZEAU C， HADJ-RABIA S， JAMBOU M， et d. Only four genes （EDA1， EDAR， EDARADD， and WNT10A） account for 90% of hypohidrotic/anhidrotic ectodermal dysplasia cases[J]. Human Mutation， 2011，32（1）： 70-72.

[4]KURAMOTO T， YOKOE M， HASHIMOTO R， et al. A rat model of hypohidrotic ectodermal dysplasia carries a missense mutation in the Edar add gene[J]. BMC Genetics， 2011， 12（1）： 91.

[5]CUI C Y， KUNISADA M， PIAO Y， et al. Dhk4 and Eda regu?late distinctive developmental mechanisms for subtypes of mouse hair[J]. PloS One， 2010， 5（4）： el0009.

[6]HARRIS M P， ROHNER N， SCHWARZ H， et al. Zebrafish eda and edar mutants reveal conserved and ancestral roles of ectodysplasin signaling in vertebrates [J]. PLoS Genetics， 2008， 4（10）： el000206.

[7]KONDO S， KUWAHARA Y， KONDO M， et al. The medaka rs-3 locus required for scale development encodes ectodys plasin-A receptor[J]. Current Biology， 2001， 11（15）： 1202-1206.

[8]QI D， CHAO Y， GUO S， et al. Convergent， parallel and correlated evolution of trophic morphologies in the subfamily schizothoracinae from the Qinghai-Tibetan plateaufJl. PloS One， 2012，7（3）： e34070.

[9]CAO W， CHEN Y， WU Y， et al. Origin and evolution of schizothoracine fishes in relation to the upheaval of the Xizang Plateau[C]//Tibetan Expedition Team of the Chinese Academy of Science. Studies on the period， amplitude and type of the uplift of the Qinghai-Xizang Plateau. Beijing： Science Press. 1981.118-130.

[10]HARRIS M P. Comparative genetics of postembryonic develo?pment as a means to understand evolutionary change [J]. Journal of Applied Ichthyology， 2012， 28（3）： 306-315.

[11]TAMURA K， PETERSON D， PETERSON N， et al. MEGA5： molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood， evolutionary distance， and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution， 2011，28（10）： 2731 - 2739.

[12]DARRIBA D，TABOADA G L， DOALLO R， et cd. jModelTest 2： more models， new heuristics and parallel computingfj]. Nature Methods， 2012， 9（8）： 772.

[13]SWOFFORD D L. PAUP*： phylogenetic analysis using parsi?mony， version 4.0 b 10[Z]. Sinauer Associates， Sunderland， Massachusetts， 2003.

[14]RONQUIST F， TESLENKO M， VAN DER MARK P， et al. MrBayes 3.2： efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space [J]. Systematic Biology， 2012， 61（3）： 539-542.

[15]YANG Z. PAML 4： phylogenetic analysis by maximum likelihood [J]. Molecular Biology and Evolution， 2007， 24（8）： 1586- 1591.

[16]蔣麗，王陽陽，程安達(dá)，等.鯉魚（Cyprinus corpio）外異蛋白A受體Edar基因的克隆及表達(dá)定位[J].生物技術(shù)通報(bào)（JIANG Li， WANG Yang -yang， CHENG An -da， et cd. Preliminary study of Edar gene cloning and localization of expression in Cyprinus carpic[J]. Biotechnology Bulletin）， 2013， （12）： 99-107.

[17]SALICHS E， LEDDA A， MULARONI L， et al. Genome-wide analysis of histidine repeats reveals their role in the localiza?tion of human proteins to the nuclear speckles compartment [J]. PLoS Genetics， 2009， 5（3）： el000397.

[18]HOEKSTRA H E， COYNE J A. The locus of evolution： evo devo and the genetics of adaptation[J]. Evolution， 2007， 61（5）： 995-1016.