草魚促性腺激素受體的克隆及表達(dá)分析

佘冬蓮 陳文娟 王艷杰 周毅 劉瓊 李建中

摘要：利用KT-PCK技術(shù)從草魚性腺中克隆出兩種促性腺激素受體基因（FSHR和LHR），采用N-J法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。通過IVr-PCK及Keal-timePCR技術(shù)對FSHR和LHR在成體草魚不同組織中的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)和LHR在草魚卵巢、精巢中表達(dá)明顯，表達(dá)量隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育逐漸增高，以上結(jié)果為進(jìn)一步探討GTHR在魚類生殖周期中的生理功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：草魚；促性腺激素受體；基因克??；表達(dá)分析

中圖分類號：Q785；Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：1007-7847（2015）01-0039-05

MolecularGeneCloningandExpressionofGonadotropinReceptorsfromCtenopharyngodonidella

SHEDong-lian，CHENWen-juan，WANGYan-jie，ZHOUYi，LIUQiong，LIJian-zhong

（CollegeofLifeSciences，HunanNormalUniversity，Changsha410081，Hunan，China）

Abstract：Twotypesofgonadotropinreceptors（FSHRandLHR）wereclonedfromthegonadsofgrasscarphyRT-PCR.Thephylogenetic*treeofGTHRbetweendifferentspeciesbyN-Jmethodwasconstructed.ThetemporalandspatialexpressionofdifferenttissuesinadultgrasscarphyRT-PCRandReal-timePCRwasanalyzed.TheresultindicatedthatFSHRandLHRweremuchhigherexpressedingonads，andtheexpres?sionlevelwassignificantlyincreasedinmatureoocytes.TheseresultslaidafoundationforthefurtherstudyonGTHRreproductivefunctionsinfish.

Keywords：grasscarp；gonadotropinreceptors；genecloning；expressionanalysis

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：039?043）

脊椎動(dòng)物的生殖周期主要由下丘腦一垂體一性腺軸調(diào)控，而垂體分泌的促性腺激素（go-nadotropinhormone，GTH）在脊椎動(dòng)物的生殖周期調(diào)控中占據(jù)中心地位，是促進(jìn)性腺發(fā)育與成熟的關(guān)鍵性激素[1、2]。但是，促性腺激素必須與相應(yīng)的受體結(jié)合才能行使其生物學(xué)功能，通過對促性腺激素受體（gonadotropinreceptors，GTHR）的研究有利于我們進(jìn)一步了解GTH在魚類生殖周期調(diào)控中的生物學(xué)功能[3]。在魚類中，存在兩種類型的促性腺激素受體GTHRⅠ和GTHRⅡ，——對應(yīng)著哺乳動(dòng)物中的促卵泡素受體（follicle-stimulatinghormonereceptor，F(xiàn)SHR）和促黃體生成素受體（luteinizinghormonereceptor，LHR）[4-7]。到目前為止，F(xiàn)SHR和LHR基因已經(jīng)在日本鰻鱺japonica）、非洲鯰魚（Clariasgariepinus）、斑馬魚（Daniorerio）、大西洋娃（Scdmosalar）、斜帶石斑魚（Epinepheluscoioides）、西氏擬隆頭魚（sieboldi）、牙漢魚（Odontesthesbonariensis）等多種硬骨魚[8-14]的性腺中被克隆，但在國內(nèi)尚未見相關(guān)的研究報(bào)道。

草魚（Ctenopharyngodonif/eWa）屬鯉形目鯉科雅羅魚亞科魚類，是我國四大家魚之一，是內(nèi)地淡水經(jīng)濟(jì)魚類中價(jià)值較高的優(yōu)質(zhì)魚類之一。本實(shí)驗(yàn)室在草魚腦垂體的起源和發(fā)生以及外源激素對草魚腦垂體GTH細(xì)胞的影響等方面巳經(jīng)做了大量的工作但是，在分子生物學(xué)方面，我們對草魚生殖周期調(diào)控的分子機(jī)理還知之甚少，有必要進(jìn)行深入的研究。本研究從分子生物學(xué)方面著手，對草魚FSHR和LHR基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)及分析，對于進(jìn)一步闡明促性腺激素及其受體在硬骨魚類生殖周期調(diào)控中作用的分子機(jī)制，完善魚類（特別是鯉科魚類）的繁殖內(nèi)分泌學(xué)研究有重要的理論意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌E.coli DH5α湖南師范大學(xué)魚類發(fā)育實(shí)驗(yàn)室保存，本實(shí)驗(yàn)所用草魚來自本實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖基地。

1.1.2試劑

無水乙醇、二甲苯、石蠟、甲醛、冰醋酸、苦味酸、蘇木精、中性樹膠（國產(chǎn)）；RevertAidFirst-strandcDNASynthesisKit、dNTP、TaqDNApoly?merase、DnaseI酶（美國Fermentas公司）；瓊脂糖（西班牙BI0WEST公司）、胰蛋白胨、酵母提取物（0X0ID），焦碳酸二乙醋（diethylpyrocarbonate，DE-PC），氨芐青霉素、EB染液、DNA膠回收試劑盒（Sangon公司）；E.Z.N.A.TotalRNAKitI（美國Omega公司）；pMD18-TVector，DNA純化試劑盒（日本Takara公司）；SYBRqPCRMix（東洋紡生物科技日本有限公司）。實(shí)驗(yàn)中所用引物均來自于試劑盒本身附帶或由Sangon公司合成，所有測序均由南京金斯瑞公司測序儀完成。

1.2方法

1.2.1目的基因克隆

用E.Z.N.ATotalRNAKitI試劑盒從草魚腦、垂體、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、腸、卵巢、精巢等組織分離出總RNA，用RevertAidFirst-Strandc.DNASynthesisKit試劑盒以oligo-dT-3'Adaptor為引物合成cDNA的第一條鏈，根據(jù)已知草魚的FSHR和LHR的開放閱讀框序列，用PrimerPrimeier5.0軟件設(shè)計(jì)FSHR和LHR特異性引物，用嵌套式PCR提高其特異性。3'RACE的特異引物為正向引物。

PCR擴(kuò)增程序按如下程序進(jìn)行：94～95T預(yù)變性3-5min；94-95℃，0.5-2min；37-70℃；，0.5～2min；70-750.5-1min；25-35個(gè)循環(huán)，最后70-75℃延伸5-10min。按UNIQ-10柱式DNA膠回收純化試劑盒說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化回收。將回收產(chǎn)物連接到PMD18-T載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，由南京金斯瑞公司測序，測序結(jié)果通過與引物拼接后，在NCBI上的BLAST（httpy/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進(jìn)行同源性物種比對，沒有堿基差異，確定克隆序列為目的序列。

1.2.2系統(tǒng)進(jìn)化分析

從GenBank中搜索日本鰻鱺、非洲鯰魚、斑馬魚、大西洋鮭、斜帶石斑魚、西氏擬隆頭魚、牙漢魚、小家鼠musculus）、雞（Gallusgallus）和人（homosapiens）的GTHR序列，運(yùn)用MEGA6.0軟件以N-J法根據(jù)不同物種構(gòu)建出FSHR和LHR的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3LHR和FSHR在草魚成體不同組織的表達(dá)分析

將提取的腦、垂體、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、腸、卵巢、精巢等組織材料質(zhì)量較好的RNA，按照1.2.1的步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄過程，只需把3sitesAdaptorPrimer換成Oligo（dt）。以β-actin為內(nèi)參作對照，按照1.2.1的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系擴(kuò)增表1的特異性引物后電泳檢測。然后采用ABI7900HTReal-timePCRSystems進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)程序?yàn)?5℃，2min；95℃，10min，之后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)（95℃，15s，60℃，45s）。設(shè)置在60℃，45s退火這一過程收集熒光。利用Livark等[17]提出的相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法，對相對定量（relative quantification，RQ）結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并用溶解曲線法檢測PCR引物結(jié)合的特異性。

1.2.4LHR和FSHR在草魚各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

將通過波恩試劑固定的卵巢材料進(jìn)行鑒定后，?、颉ⅱ?、V期的雌性草魚卵巢組織RNA，用RevertAidFirst-StrandcDNASynthesisKit試劑盒以O(shè)ligo（dT）18為引物合成cDNA的第一條鏈，根據(jù)已知草魚的FSHR和LHR的開放閱讀框序列設(shè)計(jì)合成Real-timePCR引物，引物如表2所示。然后再按照1.2.3的過程做Real-timePCR。

2結(jié)果與分析

2.1RACE擴(kuò)增結(jié)果

提取草魚性腺組織的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄形成的CDNA為擴(kuò)增模板，根據(jù)已知草魚的FSHR、LHR的開放閱讀框序列，用PrimerPrimeier5.0軟件分析設(shè)計(jì)特異性引物，通過2次嵌套式PCR擴(kuò)增出FSHR的3'端序列，結(jié)果如圖1所示，其片段大小為390bp，在NCBI上經(jīng)過Blast對比和同源性分析，證實(shí)獲得的目的序列為草魚促濾泡素激素受體FSHR的3'末端序列（草魚FSHR在GenBank搜索序列號為KJ742829）。

2.2FSHR和LHR的系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)不同物種構(gòu)建出的FSHR和LHR的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹分別如圖2和圖3所示，結(jié)果表明，草魚的FSHR與斑馬魚、非洲鯰魚的相似性最高，草魚的LHR與斑馬魚的相似性最高。

2.3LHR和FSHR在草魚成體不同組織的表達(dá)分析

草魚的腦、垂體、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、腸、卵巢、精巢組織的總RNA提取結(jié)果如圖4所示，以反轉(zhuǎn)錄形成的各組織cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示草魚GTHR在腸、腎臟和性腺組織中特異性表達(dá)，如圖5所示。

運(yùn)用相對定量PCR技術(shù)比較LHR和FSHR在草魚各組織中的特異性表達(dá)量，結(jié)果如圖6和圖7所示：在腸、腎臟、卵巢和精巢組織中特異性表達(dá)量分別為1、1.050、69.264和54.278；FSHR在肝臟、腎臟、卵巢和精巢組織中特異性表達(dá)量分別為1、1.105、68.788和60.368。數(shù)據(jù)顯示在草魚的腸、腎臟和卵巢和精巢組織中LHR的特異性表達(dá)量和草魚肝臟、腎臟和卵巢和精巢組織中FSHR的特異性表達(dá)量相近，且LHR和FSHR在性腺組織中的表達(dá)量均遠(yuǎn)高于其他組織中的表達(dá)量。

2.4LHR和FSHR在草魚卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

運(yùn)用相對定量PCR技術(shù)分析LHR和FSHR在Ⅱ、Ⅲ、V期卵巢組織中的特異性表達(dá)量，結(jié)果如圖8所示：LHR在Ⅱ、Ⅲ、V期卵巢組織中特異性表達(dá)量分別為1、5.500、40.278；FSHR在Ⅱ、Ⅲ、V期卵巢組織中特異性表達(dá)量分別為1、8.688、58.368。結(jié)果表明LHR和FSHR的特異性表達(dá)量隨著性腺的發(fā)育而不斷增加，此外，兩者在V期的卵巢組織中的特異性表達(dá)量明顯高于Ⅱ、Ⅲ期卵巢組織中的特異性表達(dá)量，并且FSHR在卵巢組織中的特異性表達(dá)量比LHR高。

總之，本研究成功地克隆出了草魚的FSHR和LHR基因。對組織表達(dá)特異性的RT-PCR的分析表明，草魚的LHR在精巢、卵巢、腎臟和心臟組織中有表達(dá)，F(xiàn)SHR在精巢、卵巢、腎臟和腸組織中有表達(dá)，并且兩者在性腺組織內(nèi)的表達(dá)量比其他組織高很多，在對人類胚胎和成體時(shí)期的研究中也有關(guān)于LHR在性腺外的組織表達(dá)的記錄，這說明促性腺激素受體可能對除性腺以外的組織有一定的作用[18]。該結(jié)果為進(jìn)一步研究促性腺激素受體對非性腺組織的影響以及這種影響引起的生理意義奠定了基礎(chǔ)。實(shí)時(shí)定量PCR分析表明了FSHR和LHR在草魚卵巢組織中的特異性表達(dá)量隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育逐漸增高，并且在卵巢組織中的特異性表達(dá)量比LHR高。LHR和這種時(shí)空表達(dá)模式與其他魚類在性腺組織中的表達(dá)是平行的這對于研究其他魚類的表達(dá)模式具有一定的參考作用。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明草魚與斑馬魚相似性最近，與其他魚類的相似性也高于人、小家鼠和雞，這與形態(tài)學(xué)上的系統(tǒng)進(jìn)化分析是一致的。

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