多花水仙HDS基因cDNA全長(zhǎng)克隆與序列分析

吳用 何炎森 李科 申艷紅 李歡 陳曉靜

摘 ?要 ?以‘黃花水仙2號(hào)和‘金盞銀臺(tái)為材料，水仙各自花瓣的cDNA為模板，采用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆出2個(gè)HDS基因，分別命名為NtHDSY和NtHDSJ，測(cè)序結(jié)果表明，NtHDSY和NtHDSJ基因全長(zhǎng)分別為2 592 bp和2 599 bp，2個(gè)基因均含有1個(gè)2 178 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼745個(gè)氨基酸。同源性分析表明，黃花水仙2號(hào)與金盞銀臺(tái)、鐵皮石斛、長(zhǎng)春花、大豆、葡萄和蘋果的相似系數(shù)分別為：97.77%、79.29%、75.29%、75.51%、75.02%和74.40%。Real-time PCR分析表明：NtHDS基因在花瓣和副冠內(nèi)的表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程的花蕾期與盛花期存在明顯差異，推測(cè)該基因可能與多花水仙香氣物質(zhì)的合成有關(guān)。

關(guān)鍵詞 ?多花水仙;HDS基因;MEP途徑;基因克隆;序列分析

中圖分類號(hào) ?S682.21 ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Cloning and Expression Analysis of HDS

Gene from Narcissus tazetta var

WU Yong1， HE Yansen1，3， LI Ke1，2， SHEN Yanhong1，2，

LI Huan1，2， CHEN Xiaojing1，2*

1 College of Horticulture，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002，China

2 Institute of Genetics and Breeding in Horticuhural Plants，F(xiàn)AFU， Fuzhou， Fujian 350002，China

3 Mintai Horticulture Research Center， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Zhangzhou，F(xiàn)ujian 363005， China

Abstract ?HDS is one of the important enzymes in the pathway of plant MEP. In this study， Huanghua Ⅱ and ?Jinzhanyintai ?were used as the experimental materials.The specific primers were designed according to the cloned HDS gene fragment and EST sequences. Two genes， named NtHDSY and NtHDSJ， were isolated from N. tazetta var by RACE and RT-PCR， and the fragments was about 2 592 and 2 599 bp， respectively. The open reading frame was 2 178 bp， encoding a polypeptide of 745 amino acids. Sequence analysis showed that the amino acid sequence of Huanghua Ⅱ shared 97.77%， 79.29%， 75.29%， 75.51%， 75.02% and 74.40% homologous with Jinzhanyintai， Dendrobium officinale， Catharanthus roseus， Glycine max， Vitis vinifera and Malus domestica，respectively. The real time RT-PCR showed that the transcription expression of HDS gene changed accordingly during flower blooming and flower organs， indicating that the possible role of HDS gene in the synthesis of aroma substances.

Key words ?Narcissus tazetta var; HDS gen; MEP pathway; Gene cloning; Sequence analysis

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.017

花香是一系列低分子量、揮發(fā)性物質(zhì)組成的復(fù)雜混合物，由花朵釋放來(lái)吸引和引導(dǎo)授粉的昆蟲[1]，是園藝觀賞植物品質(zhì)評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)，花香的合成是多種酶基因共同作用的結(jié)果。一般來(lái)說(shuō)，花香物質(zhì)可分為萜類、苯基/苯丙烷基類和脂肪酸衍生物3大類[2]。萜類在所有生物體內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)，然而在植物中尤其豐富多樣[3-4]。在多花水仙揮發(fā)性成分中，萜類物質(zhì)所占的比例最多[5]。隨著生物技術(shù)研究的不斷深入，利用基因工程手段改良植物香氣物質(zhì)的組成和含量已成為可能。

大部分的萜類化合物是由前體異戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate， IPP）碳骨架的五碳結(jié)構(gòu)單元通過(guò)單萜或倍半萜合成酶的作用合成[6]。IPP合成的途徑有2條，分別是位于細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸（mevalonic acid， MVA）途徑和位于質(zhì)體中的甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（methyl-D-eryth-ritol-4-phosphate， MEP）途徑[7-8]。其中MEP 途徑是一條高等植物合成萜類次生代謝產(chǎn)物的重要代謝途徑（圖1）[9]，該途徑是以3-磷酸甘油醛與丙酮酸為前體物質(zhì)，通過(guò)7步不同的酶促反應(yīng)生成萜類化合物的5碳單元前體IPP和二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）。HDS是MEP途徑中第6步催化反應(yīng)的酶，屬于GCPE 蛋白家族， 定位在質(zhì)體中，可催化2-C-甲基赤蘚醇-2，4-環(huán)焦磷酸（2-C-methy1-D-erythrito1 2，4-cyclodiphosphate，ME-cPP）生成羥基甲基丁烯基-4-磷酸（1-hydroxy-2-methy1-2-（E）-butenyl 4-diphosphate，HMBPP），HMBPP繼續(xù)在羥基甲基丁烯基-4-磷酸還原酶（1-hydroxy-2-methyl-2-（E）-butenyl 4-diphosphate reductase，HDR）的催化下生成IPP和DMAPP，IPP和DMAPP后經(jīng)異戊烯基轉(zhuǎn)移酶類的延伸反應(yīng)以及萜類合酶的修飾作用，合成種類繁多且功能各異的萜類化合物[10-11]。因此，HDS既是萜類物質(zhì)前體IPP合成的關(guān)鍵酶，也是單萜和雙萜類芳香物質(zhì)、類胡蘿卜素、VE和葉綠素等重要物質(zhì)合成的關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)[12]。目前，高等植物中對(duì)HDS基因開(kāi)展的研究不多，僅從可可、番茄、鐵皮石斛、長(zhǎng)春花、甜菊、杜仲、蘋果、黃花蒿等10多種植物中克隆出HDS基因cDNA全長(zhǎng)序列，對(duì)基因功能的研究?jī)H局限于少數(shù)模式植物[13-14]。為此，本研究以多花水仙為材料，根據(jù)本課題組構(gòu)建的多花水仙花瓣抑制消減雜交cDNA文庫(kù)獲得的EST序列設(shè)計(jì)特異引物，利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆出水仙HDS基因全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為后續(xù)利用多花水仙的HDS基因改良其它植物花香的轉(zhuǎn)基因研究以及深入分析多花水仙MEP代謝途徑的分子機(jī)制提供一定的參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

實(shí)驗(yàn)材料為多花水仙的2個(gè)品種，分別是取自漳州水仙生產(chǎn)基地的‘金盞銀臺(tái)和種植于福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物遺傳育種研究所的‘黃花水仙2號(hào)?！鸨K銀臺(tái)副冠橙黃色，花瓣白色;‘黃花水仙2號(hào)副冠和花瓣均為黃色，而副冠顏色較淺。分別取花蕾期和盛花期2個(gè)時(shí)期的水仙花朵的副冠和花瓣，液氮速凍后置于-80 ℃下儲(chǔ)藏備用。

1.2 ?方法

1.2.1 ?總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 ? 使用多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒（購(gòu)自北京白泰克生物有限公司），按照說(shuō)明書要求分別提取‘金盞銀臺(tái)和‘黃花水仙2號(hào)副冠和花瓣總RNA。3′-RACE模板按照Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書（購(gòu)自Fermenta）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。5′-RACE模板按照Super SMARTerTM RACE cDNA ?Amplification Kit試劑盒說(shuō)明書（購(gòu)自Contech公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按照SYBRPrime Script RT-PCR Kit（Perfect RealTime）試劑盒說(shuō)明書（購(gòu)自TaKaRa）逆轉(zhuǎn)錄的cDNA用于qRT-PCR。

1.2.2 ?‘黃花水仙2號(hào)HDS全長(zhǎng)cDNA的克隆 ? ? 根據(jù)差減文庫(kù)獲得的基因片段設(shè)計(jì)RACE引物（表1），引物合成與測(cè)序分別委托北京六合華大基因科技股份有限公司和上海博尚生物科技股份有限公司。

以‘黃花水仙2號(hào)的cDNA為模板，分別進(jìn)行5′-RACE和3′-RACE的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：9 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，50～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35循環(huán);72 ℃延伸10 min。5′端序列的克?。阂訦DS5′-1和UPM為引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，將第一輪反應(yīng)產(chǎn)物稀釋10倍作為模板，以HDS5′-2和UPM作為引物擴(kuò)增第二輪。3′端序列的克隆：以HDS3′-1和AUAP為引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，將第一輪產(chǎn)物擴(kuò)增10倍做為模板，以HDS3′-2和AUAP為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。

1.2.3 ?‘黃花水仙2號(hào)與‘金盞銀臺(tái)ORF的克隆 ? 通過(guò)DNAMAN軟件對(duì)已知的HDS片段序列和克隆得到的3′和5′端序列進(jìn)行拼接，并在DNAMAN軟件對(duì)其ORF進(jìn)行預(yù)測(cè)。再根據(jù)ORF兩端序列設(shè)計(jì)特異性上下游引物HDS-U和HDS-A，對(duì)‘黃花水仙2號(hào)和‘金盞銀臺(tái)的編碼區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增，退火溫度為55 ℃。通過(guò)凝膠電泳回收目的片段，與PGEM載體連接并轉(zhuǎn)化DH5α（Escherichia coli.），經(jīng)菌液鑒定后送往博尚生物科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 ?序列分析 ? 氨基酸多重序列比對(duì)和CDD功能區(qū)域分析使用NCBI中的BLASTX（http：//blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi）;氨基酸理化分析使用ExPASy-ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam）;構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹使用MEGA5.05中的鄰近相法neighbor-joining tree;氨基酸序列信號(hào)肽預(yù)測(cè)使用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）;氨基酸序列跨膜預(yù)測(cè)使用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）;亞細(xì)胞定位使用softberry（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml）。

1.2.5 ?‘黃花水仙2號(hào)和‘金盞銀臺(tái)qRT-PCR分析 ? 以Actin作為內(nèi)參基因，2種水仙的cDNA模板均稀釋5倍，HDSY-L和HDSY-R為上下游引物來(lái)檢測(cè)HDSY基因在2種水仙中不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄水平。使用25 μL qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.5 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.5 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 9.5 μL，每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)。qRT-PCR程序?yàn)椋篠tage1：預(yù)變性，94 ℃，3 min;Stage2： PCR反應(yīng)，94 ℃變性15 s;56 ℃退火35 s，40循環(huán)。Stage3：Dissociation。反應(yīng)結(jié)束后，分析Bio-Rad CFX96中的熔解曲線和擴(kuò)增曲線，導(dǎo)出數(shù)據(jù)。從不同時(shí)期的相關(guān)基因擴(kuò)增曲線中得到Ct值，通過(guò)action的校正最終得到目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用2-△△ct（Livak）法，用Excel軟件處理和分析數(shù)據(jù)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?多花水仙HDS基因cDNA全長(zhǎng)克隆

以提取的‘黃花水仙2號(hào)總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳后發(fā)現(xiàn)，5′RACE和3′RACE均獲得約800 bp的片段（圖2）。經(jīng)過(guò)測(cè)序并將結(jié)果同其原始已知HDS序列進(jìn)行拼接，得到長(zhǎng)度為2 483 bp的基因片段，通過(guò)BLAST程序檢索，發(fā)現(xiàn)該序列與葡萄（登錄號(hào)：XP 002285130.1）、長(zhǎng)春花（登錄號(hào)： AAO24774.1）和鐵皮石斛（登錄號(hào)： AHN91473.1）的HDS基因mRNA序列的同源性分別達(dá)到68.64%、66.48%和71.16%，可初步確定該基因片段為‘黃花水仙2號(hào)的HDS基因片段。

2.2 ?‘黃花水仙2號(hào)和‘金盞銀臺(tái)HDS基因ORF的克隆與分析

根據(jù)上述拼接的‘黃花水仙2號(hào)cDNA全長(zhǎng)，分別設(shè)計(jì)用于基因3′RACE和5′RACE序列擴(kuò)增的特異引物（HDS-U， HDS-A），對(duì)‘黃花水仙2號(hào)和‘金盞銀臺(tái)水仙HDS基因全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出2 592 bp和2 599 bp大小的條帶。測(cè)序結(jié)果表明，‘黃花水仙2號(hào)ORF為2 238 bp，編碼745個(gè)氨基酸;金盞銀臺(tái)ORF為2 238 bp，編碼745個(gè)氨基酸?！S花水仙2號(hào)和‘金盞銀臺(tái)的HDS基因分別命名為NtHDS40Y（登錄號(hào)： KM593243）和NtHDS40J（登錄號(hào)：KM593244）。

2.3 ?多花水仙HDS基因的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy-ProtParam推測(cè)2種水仙HDS蛋白，蛋白分子量、等電點(diǎn)、分子式、GRAVY（Grand average of hydropathicity）值、不穩(wěn)定指數(shù)（表2）等基本理化性質(zhì)，2種水仙的HDS蛋白均屬于穩(wěn)定蛋白。經(jīng)TMHMM2.0預(yù)測(cè)，2種類型水仙的HDS蛋白跨膜螺旋數(shù)均為0，不形成跨膜區(qū)域，均不是跨膜蛋白。經(jīng)SignalP4.1預(yù)測(cè)，2種類型水仙的HDS蛋白均無(wú)信號(hào)肽，故為非分泌蛋白。經(jīng)Softberry在線工具分析，亞細(xì)胞均定位于膜結(jié)合葉綠體中。經(jīng)NCBI-CDS在線分析，推測(cè)此蛋白屬于GcpE Superfamily的成員。

根據(jù)開(kāi)放閱讀框推導(dǎo)的氨基酸進(jìn)行同源序列比對(duì)分析（圖3）， ‘黃花水仙2號(hào)與鐵皮石斛（Dendrobium officinale）、 長(zhǎng)春花（Catharanthusroseus）、 大豆（Glycine max）、 葡萄（Vitis vinifera）、 蘋果（Malus domestica）的相似性分別為： 85.66%、 84.97%、 84.70%、 84.03%和82.01%。說(shuō)明這個(gè)基因的保守性較高，‘黃花水仙2號(hào)與‘金盞銀臺(tái)也存在一定的氨基酸差異，相似性為97.32%。

為了研究HDS的進(jìn)化關(guān)系，用MEGA5.05軟件構(gòu)建了HDS的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），分析表明，‘黃花水仙2號(hào)與‘金盞銀臺(tái)處于同一分支上，與‘黃花水仙2號(hào)進(jìn)化距離比較遠(yuǎn)的是雙子葉植物甜橙、可可、蘋果、梅和葡萄，與單子葉植物鐵皮石斛進(jìn)化最為相近，馬鈴薯和番茄同屬于茄科，因此它們處在進(jìn)化樹同一分支上?？傮w上來(lái)看，進(jìn)化樹基本上與植物分類學(xué)相一致。

2.4 ?多花水仙HDS基因在不同發(fā)育期的表達(dá)分析

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增曲線和相關(guān)數(shù)據(jù)，制得‘黃花水仙2號(hào)和‘金盞銀臺(tái)花瓣與副冠在不同時(shí)期HDS基因的表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)圖（圖5）。分析表明，NtHDSY和NtHDSJ的表達(dá)水平在花瓣（P）和副冠（C）上的變化趨勢(shì)類似，在花蕾期向盛花期轉(zhuǎn)變過(guò)程中，花瓣和副冠中的HDS表達(dá)水平均呈上升趨勢(shì)?？赡苁怯捎贜tHDS是花香的主要成分萜類物質(zhì)合成途徑中的重要酶類基因，表達(dá)水平的高低可能與花香物質(zhì)的合成量多少有關(guān)。在花蕾期，花瓣沒(méi)有綻放，無(wú)明顯香味，NtHDS表達(dá)量相對(duì)偏低;而在盛花期，花瓣綻放，花香濃郁，NtHDS的表達(dá)量也較高。

3 ?討論與結(jié)論

HDS是植物萜類物質(zhì)合成MEP途徑中催化第六步反應(yīng)所需的酶，該途徑產(chǎn)生的萜類吲哚生物堿（TIAs）是類異戊二烯生物合成的前體物質(zhì)， 因此HDS被認(rèn)為是類異戊二烯生物合成途徑中代謝紐帶的一個(gè)理想的目標(biāo)基因[15]。本研究分離并且描述了2種多花水仙中的HDS基因。依據(jù)生物信息學(xué)的方法，對(duì)多花水仙HDS基因進(jìn)行多角度的分析結(jié)果表明：HDS基因編碼的蛋白質(zhì)無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。從不同植物HDS基因編碼氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)的結(jié)果可知，不同植物HDS基因序列存在一定的差異性，包括同屬水仙屬的‘黃花水仙2號(hào)和‘金盞銀臺(tái)之間，也存在2.68%的差異性，但從總體上來(lái)看，不同植物間HDS基因序列的保守性較高;基于不同植物HDS基因編碼氨基酸序列的進(jìn)化樹上分析可知，不同植物HDS蛋白的功能在進(jìn)化上是較為保守的，2個(gè)品種水仙在進(jìn)化上處于同一分支上，而與2種水仙在進(jìn)化上更為相近的是單子葉植物而不是雙子葉植物，同屬茄科的番茄和馬鈴薯在進(jìn)化樹上也處于同一分支，這些均與植物分類學(xué)一致。

多花水仙開(kāi)花過(guò)程中香味的變化較為明顯。在花蕾期，香氣物質(zhì)合成水平較低，花瓣包裹較為嚴(yán)密，無(wú)明顯香味，此時(shí)不需要昆蟲授粉;而在盛花期，香氣物質(zhì)合成水平相對(duì)較高，花瓣展開(kāi)，柱頭分泌粘液，花藥散出花粉，花香濃郁，大量香氣物質(zhì)的釋放會(huì)吸引授粉的昆蟲，這一時(shí)期正是授粉的最佳時(shí)期。本研究結(jié)果顯示，HDS的轉(zhuǎn)錄水平在開(kāi)花過(guò)程中花蕾期和盛花期呈明顯的時(shí)序性。盛花期HDS基因無(wú)論是在花瓣還是副冠中，它的表達(dá)量都明顯高于花蕾期，這與花香物質(zhì)的合成是一致的。由于盛花期，植物需要合成更多的香氣物質(zhì)去吸引昆蟲前來(lái)授粉，異花授粉產(chǎn)生的植物多樣性有利于生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)，從而來(lái)保證后代遺傳的多樣性和穩(wěn)定性，盛花期花香物質(zhì)的大量合成是多花水仙與授粉昆蟲協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果。

目前，高等植物中對(duì)HDS基因開(kāi)展的研究不多，對(duì)于基因功能的研究局限于少數(shù)模式植物[16-18]，尚未涉及有關(guān)多花水仙HDS基因的報(bào)道。水仙是中國(guó)十大名花之一，也是福建省的省花，具有非常高的觀賞價(jià)值，因此克隆出多花水仙萜類代謝途徑中的HDS基因具有很好的應(yīng)用前景。一方面擴(kuò)充了多花水仙的基因庫(kù)，可以給植物花香相關(guān)的轉(zhuǎn)基因研究直接提供目的基因，另一方面能夠?qū)Χ嗷ㄋ蒑EP途徑分子機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。茉莉酸甲酯（MeJA）和紫外（UV）可使得MEP途徑中HDS上游的一個(gè)酶基因MECs的表達(dá)上調(diào)，被稱為誘導(dǎo)子，然而包含茉莉酸甲酯（MeJA），紫外（UV）， ?脫落酸（ABA）和丙烯腈（ASA）在內(nèi)的誘導(dǎo)子對(duì)于HDS基因的表達(dá)均無(wú)直接響。因此，需進(jìn)一步研究能夠使HDS表達(dá)上調(diào)的誘導(dǎo)子，再利用基因工程的手段，以期增加TIAs的產(chǎn)量，有效地改良植物花香，更好的誘導(dǎo)昆蟲前來(lái)授粉，從而保證了植物群體遺傳的多樣性和穩(wěn)定性，提高園藝植物觀賞價(jià)值，同時(shí)對(duì)植物花香精油產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有一定推動(dòng)作用。

參考文獻(xiàn)

[1] 張 ?強(qiáng)， 田彥彥， 孟月娥， 等. 植物花香基因工程研究進(jìn)展[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2009， 28（1）： 159-166.

[2] Campbell T L，Brown E D. Characterization of he depletion of 2-C-Methyl-D-Erythritol-2，4-Cyclodiphosphate ?synthase in Escherichia coli and Bacillus subtilis[J]. Bacteriol， 2002， 184：5 609-5 618.

[3] Chappell J. Biochemistry and molecular biology of the isoprenoid biosynthetic pathway in plants[J]. Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol， 1995， 46： 521-547.

[4] McGravey D J， Croteau T. Terpene metabolism[J]. Plant cell，1995， 7： 1 015-1 026.

[5] Kuzuyama T， Seto H. Diversity of the biosynthesis of the isoprene units[J]. Nat Prod Rep， 2003， 20： 171-183.

[6] Rodriguez-Concepcio'N M， Querol J， Lois L M， et al. Bioinformatic and molecular analysis of hydroxymethylbuteny1 diphosphate synthase （GCPE） gene expression during carotenoid accumulation in ripening tomato fruit[J]. Planta， 2003， 217：476-482.

[7] Liao Z， Chen M， Gong Y， et al. A new geranylgerany1 diphosphate synthase gene from Ginkgo biloba， which intermediates the biosynthesis of the key precursor for ginkgolides[J]. DNA Seq， 2004， 15： 153-158.

[8] Chappell J. Biochemistry and molecular biology of the isoprenoid biosynthetic pathway in plants[J]. Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol， 1995， 46： 521-547.

[9] Yue Zheng， Min Chen， Chunxian Yang， et al. Cloning and characterization of MECS and HDS genes from Rauvolfia verticillata[J]. Plant Omics， 2011， 4（2）： 82-92.

[10] Dudareva N， Andersson S， orlova I， et al. The nonmenalonate pathway supports monoterpene and Sequiterpene formation in snapdragon flowers[J]. Pore Nat1 Acad Sci USA， 2005， 102（3）： 933-938.

[11] 姜 ?丹， 榮齊仙， 袁慶軍， 等. 白花丹參HDS基因的全長(zhǎng)克隆與原核表達(dá)分析[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 11： 27.

[12] Pichersky D N. Biochemistry and molecular aspects of floral scent[J]. Plant Physiol， 2000， 122： 627-634.

[13] Gil M J， Coego A， Mauch-Mani B， et al. The Arabidopsis csb3 mutant reveals a regulatory link between salicylic acid-mediated disease resistance and the methyl-erythritol 4-phosphate pathway[J]. Plant， 2005， 44： 155-166.

[14] Kim S M， Kim S U. Characterization of 1-hydroxy-2-methyl-2-（E）-butenyl-4-diphosphate synthase（HDS）gene from Ginkgo biloba[J]. Mol Biol Rep， 2010， 37： 973-979.

[15] Altincicek B， Duin E C， Reichenberg A et al. LytB protein catalyzes the terminal step of the 2-Cmethyl-D-erythritol-4-phosphate pathway of ?isoprenoid ?biosynthesis[J]. FEBS Lett，2002， 532： 437-440.

[16] Manuel R C， Jordi Q， Luisa M L， et al. Bioinformatic and molecular analysis of hydroxymethylbutenyl diphosphate synthase （GCPE） gene expression during carotenoid accumulation in ripening tomato fruit[J]. Planta， 2003， 217：476.

[17] Sang Min K. Soo Un K. Characterization of 1-hydroxy-2-methyl-2-（E）-butenyl-4-diphosphate synthase （HDS） gene from Ginkgo biloba[J]. Mol Biol Rep， 2010， 37： 973-979.

[18] Jordi Q， Narciso C， Santiago I， et al. Functional analysis of the Arabidopsis thaliana GCPE protein involved in plastid isoprenoid biosynthesis[J]. FEBS Lett， 2002， 514： 343-346.