利用ID—ELISA技術(shù)調(diào)查分析海南3種主要番木瓜病毒分布及感病情況

楊勇 庹德財(cái) 沈文濤 言普 黎小瑛 周鵬 王銳萍

摘 ?要 ?利用PCR方法分別擴(kuò)增番木瓜環(huán)斑病毒（papaya ringspot virus，PRSV）、番木瓜畸形花葉病毒（papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV）和番木瓜花葉病（papaya mosaic virus，PaMV）的外殼蛋白（coat protein，CP）基因，并連接到原核表達(dá)載體pET-28a上，獲得重組質(zhì)粒pET28-PRSV-CP、pET28-PLDMV-CP和pET28-PaMV-CP，通過轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，這3種CP蛋白在大腸桿菌中高效表達(dá)，其中PRSV CP蛋白和PLDMV CP以包涵體形式存在，PaMV CP以可溶蛋白形式存在。利用Ni2+-NTA瓊脂糖親和層析純化獲得了3種病毒的重組CP蛋白，并免疫大白兔獲得高效價(jià)的抗體。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，這3種抗血清與對(duì)應(yīng)的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白發(fā)生特異反應(yīng)。再采用抗血清建立一種快捷、簡(jiǎn)便和低成本的ID-ELISA（Indirect enzyme-linked immunosorbent assay）技術(shù)，并利用此技術(shù)對(duì)海南島283個(gè)疑似感病的番木瓜樣品進(jìn)行檢測(cè)鑒別，初步掌握了海南島3種主要番木瓜病毒的分布及感病情況，為下一步該病的有效防治策略提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 ?番木瓜病毒;外殼蛋白;抗血清;ID-ELISA

中圖分類號(hào) ?S41-30 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Survey on Distributions and Infectious Status of Three Main Kinds

of Papaya Virus by ID-ELISA in Hainan

YANG Yong1，2， TUO Decai1， SHEN Wentao1， YAN Pu1，

LI Xiaoying1， ZHOU Peng1 *， WANG Ruiping2 *

1 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of

Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

2 College of Life Science， Hainan Normal University， Haikou， Hainan 571158， China

Abstract ?The CP genes were amplified from PRSV， PLDMV and PaMV sequences by PCR，which were kept in our laboratory. Then the CP genes were connected to prokaryotic expression vector of pET-28a， after identification by enzyme digestion and sequencing， the three recombinant plasmids of pET28-PRSV-CP，pET28-PLDMV-CP and pET28-PaMV-CP were transformed into the expressing bacteria BL21（DE3）. The CP genes were expressed efficiently with IPTG inducing by SDS-PAGE analysis. PRSV CP and PLDMV CP existed in the form of inclusion body， while PaMV CP expressed in the soluble form. The expressed proteins were purified with Ni2+-NTA agarose affinity chromatography and were used as antigens to immunize the rabbits for antiserum preparation. Western blot analysis confirmed that the antiserum only reacted with the corresponding expressed induced protein. 283 of unhealthy papaya leaves collected on the whole Hainan were tested by ID-ELISA. This study would preliminarily establish the distribution of papaya virus in Hainan， and provid scientific basis and a effective method for the prevention of papaya virus.

Key words ?Papaya viru; Coat protein; Antibody; ID-ELISA

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.024

海南島地處熱帶和亞熱帶地區(qū)，氣候溫暖，自然條件優(yōu)越，是中國(guó)番木瓜的主要種植區(qū)，但是病毒病是困擾番木瓜生產(chǎn)的主要因素，之前普遍認(rèn)為危害海南番木瓜種植主要因素來自PRSV[1-2]，然而近年來在海南地區(qū)番木瓜植株上發(fā)現(xiàn)了PLDMV[3]和PaMV[4]，這3種病毒均為RNA病毒，侵染番木瓜后均出現(xiàn)葉片卷曲、花葉、果實(shí)有環(huán)斑狀水漬等相似的癥狀[1-4]，無法用常規(guī)的方法區(qū)分，給鑒別和防治帶來了諸多困難。然而，采用電鏡方法可直接觀察到病毒生物大分子的亞基單位，從而可以對(duì)病毒進(jìn)行鑒定和分類[5]，但是電鏡價(jià)格昂貴，操作要求嚴(yán)格，無法在大規(guī)模檢測(cè)中應(yīng)用;基于分子生物學(xué)的PCR檢測(cè)技術(shù)在檢測(cè)植物病毒中雖然具有高特異性和靈敏性，但是由于需要擴(kuò)增設(shè)備，只能局限在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作[6]，耗時(shí)長(zhǎng)和成本較高，也不能適用于大規(guī)模的檢測(cè)。

基于血清學(xué)的酶聯(lián)免疫吸附法操作簡(jiǎn)單快捷、成本低、不需要復(fù)雜儀器，即可進(jìn)行快速檢測(cè)[7]，可以用于大規(guī)模的病毒檢測(cè)，但是利用病毒粒子制備的抗血清過程復(fù)雜，特異性不高，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的現(xiàn)象[8]。隨著近年來分子生物學(xué)的不斷發(fā)展和原核表達(dá)技術(shù)的成熟，通過基因工程的途徑，在蛋白酶缺陷性的大腸桿菌中表達(dá)病毒的CP基因獲得病毒外殼蛋白，以純化的重組蛋白作為抗原用來制備高特異性的抗血清，是目前抗血清制備的最為快捷有效的方式，可以解決使用病毒粒子制備抗血清特異性不高和效價(jià)不高的現(xiàn)象[9-10]。趙芹等利用原核表達(dá)技術(shù)制備了PRSV CP重組蛋白，通過免疫制備抗血清用于PRSV的檢測(cè)[11]，Bau等[12]利用原核表達(dá)技術(shù)制備了PLDMV CP蛋白用于PRSV和PLDMV血緣關(guān)系分析，但目前為止，尚未見利用原核表達(dá)技術(shù)制備商品化抗血清。為便于快速精確檢測(cè)海南地區(qū)番木瓜病毒分布情況和種類，本研究利用PRSV、PLDMV和PaMV這3種病毒的重組CP蛋白制備抗血清，對(duì)海南島283個(gè)疑似感病的番木瓜樣品進(jìn)行檢測(cè)，建立一套簡(jiǎn)單、快捷、適于規(guī)?；行z測(cè)和鑒別病毒的ID-ELISA技術(shù)，將有助于大量快速地調(diào)查番木瓜病毒的分布情況和鑒別病毒種類，從而有利于預(yù)警預(yù)報(bào)繼而采取針對(duì)性的防控措施，對(duì)番木瓜種植業(yè)及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

基因來源：含PRSV、PLDMV、PaMV全長(zhǎng)基因質(zhì)粒（Genbank登錄號(hào)分別為JX974555、HQ424465和JX524226），均為本實(shí)驗(yàn)室克隆保存;菌株來源：trans 10和BL21（DE3），購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;載體：pET-28a，購(gòu)自Novagen公司。

根據(jù)這3種病毒的CP基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物并分別在上游引物和下游引物添加NcoⅠ酶切位點(diǎn)和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，見表1所示，由上海英濰捷基公司合成。

1.2 ?方法

1.2.1 ?PRSV、PLDMV、PaMV的CP基因擴(kuò)增

以PRSV、PLDMV和PaMV全長(zhǎng)基因質(zhì)粒為模板，參照表1中的引物，采用PCR擴(kuò)增PRSV、PLDMV和PaMV的CP基因。反應(yīng)體系：PRSV、PLDMV和PaMV全長(zhǎng)基因的質(zhì)粒0.5 μL、Pyrobest DNA Polymerase（日本TaKaRa）0.5 μL、dNTPs 8 μL、上下游引物各1 μL、10×Pyrobest BufferⅡ 5 μL、RNase-free Water 32.5 μL，共50 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s、52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃終延伸5 min，共30個(gè)循環(huán)。

1.2.2 ?原核表達(dá)載體的構(gòu)建 ? 3個(gè)CP基因膠回收片段和pET-28a載體分別利用NcoⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)體系：回收片段/pET-28a載體12.5 μL，NcoⅠ、XhoⅠ各1 μL，10×FD Green Buffer 2.5 μL，RNase-free Water 7 μL，共計(jì)25 μL，37 ℃酶切2 h后使用1%瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)擴(kuò)增片段和載體進(jìn)行膠回收，再經(jīng)T4 DNA Ligase連接。反應(yīng)體系：T4 DNA Ligase 0.5 μL，pET-28a載體2 μL，10×ligase Buffer 1 μL，回收片段4 μL，RNase-free Water 2.5 μL，共計(jì)10 μL，4 ℃連接過夜后轉(zhuǎn)化大腸桿菌trans 10，篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序，再提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.3 ?CP基因的誘導(dǎo)表達(dá)及熱可溶性分析 ? 將構(gòu)建好的3個(gè)原核表達(dá)載體pET28-PRSV-CP、pET28-PLDMV-CP和pET28-PaMV-CP分別轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3），挑取陽(yáng)性克隆的單菌落，接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600約為0.8，分別向3個(gè)表達(dá)菌液中加入30 μL 0.1 mol/L的IPTG ，使IPTG的終濃度為0.3 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)3 h后5 000 r/min離心5 min收集菌體，加入細(xì)胞裂解緩沖液（140 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-Cl、5 mmol/L EDTA，pH值8.0）20 mL，冰上放置超聲波破碎10 min，15 000 r/min離心15 min，分離上清和沉淀，用含有8 mol/L的平衡液（20 mmol/L咪唑、20 mmol/L Tris-Cl、500 mmol/L NaCl，pH值8.0）溶解沉淀，取菌體裂解液的上清和沉淀溶液各10 μL，SDS-PAGE分析3種CP蛋白的可溶性。

1.2.4 ?表達(dá)蛋白的純化及定量 ? SDS-PAGE分析顯示，PRSV CP和PLDMV CP蛋白以不溶的包涵體形式存在，PaMV CP蛋白以可溶蛋白形式存在，取PRSV CP、PLDMV CP沉淀溶液和PaMV上清，利用Ni2+-NTA瓊脂糖親和層析柱（BIO-RAD）對(duì)這3種蛋白進(jìn)行純化。純化后的蛋白經(jīng)PBS（pH8.0）透析3次后，利用分光光度計(jì)測(cè)量這3種蛋白在260 nm和280 nm的光吸收值，根據(jù)公式（蛋白濃度（mg/mL）=1.45OD280-0.74OD260）計(jì)算出這3種蛋白的濃度。

1.2.5 ?抗血清的制備及效價(jià)的測(cè)定 ? 將純化后的蛋白均稀釋至0.5 mg/mL，各取0.5 mL加入等體積的弗氏佐劑乳化后靜脈注射大白兔，其后的4次注射利用弗氏不完全佐劑乳化抗原，每次間隔7 d，最后1次注射10 d后心臟取血制備抗血清，利用ID-ELISA法測(cè)定抗血清的效價(jià)。

1.2.6 ?Western blot分析 ? 表達(dá)菌體裂解后進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，分別用制備的3種抗血清作為一抗，5 000倍稀釋堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗進(jìn)行western blot分析抗血清特異性。

1.2.7 ?樣品的檢測(cè)分析 ? 本實(shí)驗(yàn)室保存的感染PRSV、PLDMV和PaMV的樣品各取3個(gè)進(jìn)行ID-ELISA檢測(cè)，再根據(jù)這3種病毒序列設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)樣品進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。從海南島采集感病的番木瓜葉片樣品，以幼葉出現(xiàn)斑駁、畸形、花葉等癥狀為基準(zhǔn)，共采集樣品283個(gè)，每個(gè)樣品的間隔距離大于10 km，其中保亭8個(gè)、昌江25個(gè)、澄邁13個(gè)、東方28個(gè)、?？?5個(gè)、樂東27個(gè)、陵水19個(gè)、瓊海8個(gè)、瓊中18個(gè)、三亞31個(gè)、屯昌11個(gè)、萬寧9個(gè)、文昌33個(gè)、五指山9個(gè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?PRSV、PLDMV、PaMV的CP基因擴(kuò)增

以PRSV、PLDMV和PaMV全長(zhǎng)基因的質(zhì)粒為模板，分別擴(kuò)增出了約900、900和650 bp大小的片段，和預(yù)期的結(jié)果相符，見圖1所示。

2.2 ?原核表達(dá)載體構(gòu)建

對(duì)3種重組質(zhì)粒進(jìn)行NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，出現(xiàn)2個(gè)條帶（圖2），其中載體大小約5 500 bp，測(cè)序結(jié)果顯示，插入的片段閱讀框均未發(fā)生移碼突變，表明已成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28-PRSV-CP、pET28-PLDMV-CP和pET28-PaMV-CP。

2.3 ?CP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

原核表達(dá)載體pET28-PRSV-CP、pET28-PLDMV-CP和pET28-PaMV-CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），IPTG終濃度0.3 mmol/L誘導(dǎo)3 h后，誘導(dǎo)組分別在38、38和26 ku出現(xiàn)特異性條帶，而空載體對(duì)照組和未誘導(dǎo)的菌液在此處沒有出現(xiàn)條帶（圖3）。由于表達(dá)蛋白的氨基酸序列含有組氨酸標(biāo)簽，使得其在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度較慢，所以電泳得到的片段比理論大?。≒RSV CP、PLDMV CP、PaMV CP分別是34.6、33.9、24.1 ku）稍微大一些[13]。因此可以判定SDS-PAGE所測(cè)結(jié)果與預(yù)期相符。

2.4 ?蛋白的可溶性分析

表達(dá)菌體經(jīng)超聲波破碎后，離心分離沉淀和上清，然后經(jīng)過12% SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，原核表達(dá)PRSV CP和PLDMV CP蛋白主要以不可溶的包涵體形式存在，可溶蛋白含量很少;PaMV CP蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在，包涵體形式的蛋白很少（圖4）。

2.5 ?蛋白的純化及定量

以包涵體形式表達(dá)的PRSV CP和PLDMV CP蛋白沉淀用含有8 mol/L尿素的平衡液溶解后，再利用Ni2+-NTA瓊脂糖親和層析柱進(jìn)行純化;可溶性PaMV CP蛋白的離心上清液直接加入到Ni2+-NTA瓊脂糖親和層析進(jìn)行純化，成功去除了雜蛋白。測(cè)定透析后蛋白的濃度分別為0.95、0.84和1.12 mg/mL（圖5）。

2.6 ?抗血清制備和效價(jià)測(cè)定

將純化的3個(gè)CP蛋白免疫大白兔，獲得PRSV、PLDMV和PaMV的抗血清，抗血清效價(jià)及工作濃度分別以純化不同稀釋倍數(shù)的CP蛋白為抗原進(jìn)行ID-ELISA測(cè)定，結(jié)果顯示：抗血清稀釋106倍仍可以明顯的呈陽(yáng)性反應(yīng)（表2）。

2.7 ?Western Blot分析結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，當(dāng)以PRSV抗血清作為一抗時(shí)，在第一泳道38 ku處有特異性條帶（圖6-A）;當(dāng)以PLDMV抗血清作為一抗時(shí)，在第二泳道38 ku處有特異性條帶（圖6-B）;當(dāng)以PaMV抗血清作為一抗時(shí)，在第三泳道26 ku處有特異性條帶（圖6-C）。表明這3個(gè)抗血清之間不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，誘導(dǎo)蛋白僅和對(duì)應(yīng)的抗血清發(fā)生反應(yīng)，以此判定3種抗血清具有高特異性。

2.8 ?樣品的檢測(cè)與分析

用本研究中制備的3種抗血清對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的感病樣品進(jìn)行ID-ELISA檢測(cè)，感病樣品均和對(duì)應(yīng)的抗血清發(fā)生反應(yīng)，而不與其他抗血清發(fā)生反應(yīng)，健康樣品與這3種抗血清均不發(fā)生反應(yīng)（圖7所示）。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果與ID-ELISA檢測(cè)結(jié)果相符。

對(duì)海南島各市縣采集到的283個(gè)樣品進(jìn)行ID-ELISA檢測(cè)，在檢測(cè)的樣品中，有170個(gè)樣品感染了PRSV，占60.2%，在各個(gè)市縣均有發(fā)現(xiàn)，并呈隨機(jī)分布;有12個(gè)樣品感染了PLDMV，占4.2%，只分布于樂東和東方地區(qū);感染PaMV的樣品有2個(gè)，占0.7%，僅在海口發(fā)現(xiàn)。在檢測(cè)的樣品中，有2個(gè)樣品同時(shí)感染了PRSV和PLDMV（表3）。

3 ?討論與結(jié)論

在本研究中，3種工程菌株經(jīng)過終濃度為0.3 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3 h，目的蛋白得以高效表達(dá)，表達(dá)的3種病毒CP蛋白中，其中PRSV CP和PLDMV CP是以不可溶的包涵體形式表達(dá)，PaMV CP以可溶蛋白的形式表達(dá)。在同樣的表達(dá)和誘導(dǎo)條件下，包涵體的出現(xiàn)，可能與蛋白質(zhì)的氨基酸序列有關(guān)。包涵體蛋白無法直接用于免疫大白兔，將包涵體形式表達(dá)的蛋白通過復(fù)性的方式，可以形成可溶的蛋白以便用于后續(xù)試驗(yàn)。

本研究制備的3種抗血清，不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，是ID-ELISA檢測(cè)番木瓜病毒的前提條件。在檢測(cè)的過程中，注意抗血清的稀釋比例應(yīng)適當(dāng)，抗血清含量高容易形成假陽(yáng)性，含量過低又無法檢測(cè)到病毒。通過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，確定了檢測(cè)的工作濃度。以感病葉片為抗原的試驗(yàn)中，當(dāng)抗血清稀釋10～100倍時(shí)，健康葉片和空白對(duì)照都出現(xiàn)顯色反應(yīng)，說明抗血清濃度過高，在酶標(biāo)板中本底反應(yīng)較為明顯，不適用于樣品的檢測(cè);當(dāng)抗血清的稀釋倍數(shù)在103到106時(shí)，感病葉片有顯色，健康葉片的對(duì)照和空白均不顯色;當(dāng)稀釋大于等于106倍時(shí)，感病樣品和對(duì)照組都不出現(xiàn)顯色反應(yīng)，因此3種抗血清稀釋103到106倍作為檢測(cè)的工作濃度較為合適。

近年來有報(bào)道稱在墨西哥和菲律賓發(fā)現(xiàn)PRSV和PaMV同時(shí)侵染番木瓜植株的現(xiàn)象[14-15]，在中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)和海南地區(qū)發(fā)現(xiàn)有PLDMV侵染抗PRSV轉(zhuǎn)基因植株的現(xiàn)象[12，16]，本研究利用ZO-ELISA技術(shù)在海南發(fā)現(xiàn)了PRSV和PLDMV同時(shí)侵染番木瓜的現(xiàn)象，預(yù)示著在海南番木瓜病毒可能會(huì)以新的發(fā)病方式危害其種植業(yè)，必須盡早采取有效的防治措施。因此，對(duì)番木瓜病毒分布及感病情況作進(jìn)一步調(diào)查，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并消滅病毒源，同時(shí)對(duì)新出現(xiàn)的病毒混和侵染番木瓜的分子機(jī)制作深入探究十分重要，結(jié)果可為有效控制番木瓜病毒病情的防控策略制定提供科學(xué)依據(jù)。

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