自噬參與低氧預(yù)處理抗PC12細(xì)胞糖氧剝奪損傷過程*

盧　娜，魏林郁，王寶英，李新娟，李超堃，白瑞櫻，李東亮(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與神經(jīng)生物學(xué)教研室，河南新鄉(xiāng)453003)

自噬參與低氧預(yù)處理抗PC12細(xì)胞糖氧剝奪損傷過程*

盧娜△，魏林郁，王寶英，李新娟，李超堃，白瑞櫻，李東亮
(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與神經(jīng)生物學(xué)教研室，河南新鄉(xiāng)453003)

［摘要］目的:觀察低氧預(yù)處理(HPC)對(duì)氧糖剝奪(OGD)損傷的PC12細(xì)胞的作用，同時(shí)探討自噬在其中的作用。方法:培養(yǎng)的PC12細(xì)胞按照處理因素分為6組:對(duì)照組、HPC模型組、3-甲基腺嘌呤(3-MA)組、低氧預(yù)處理后氧糖剝奪(HPC+ OGD)組、3-甲基腺嘌呤預(yù)處理后行低氧預(yù)處理及氧糖剝奪(3-MA+ HPC+ OGD)組和OGD組。CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率; caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)酶活性; TUNEL染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況; Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、beclin-1和凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達(dá)。結(jié)果:與對(duì)照組相比，OGD組細(xì)胞存活率明顯降低;與3-MA+ HPC+ OGD組及OGD組相比，HPC+ OGD組細(xì)胞存活率明顯升高(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，OGD組細(xì)胞的caspase-3酶活性明顯升高;與3-MA+ HPC+ OGD組及OGD組相比，HPC+ OGD組的caspase-3酶活性明顯降低(P＜0.05)。與對(duì)照組相比OGD組細(xì)胞凋亡明顯增多; HPC+ OGD組與OGD組相比凋亡明顯減少(P＜0.05)。此外，與對(duì)照組相比，OGD組的激活型caspase-3蛋白水平明顯升高(P＜0.05) ;且HPC+ OGD組與OGD組相比激活型caspase-3蛋白水平明顯減少而LC3、beclin-1的蛋白水平明顯升高(P＜0.05)。結(jié)論: HPC抗OGD損傷的機(jī)制可能與其激活細(xì)胞自噬有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］自噬;細(xì)胞凋亡;低氧預(yù)處理;氧糖剝奪

［修回日期］2015-06-01

腦血管病以其高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率而嚴(yán)重危害人類健康，其中缺氧缺血性腦血管病約占70%。但遺憾的是，目前沒有有效預(yù)防和治療的方法。對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究及如何啟動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制以尋找有效的防治手段仍然是該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。低氧預(yù)處理(hypoxic preconditioning，HPC)是指1次或多次短暫、非致死性低氧刺激后，機(jī)體獲得的對(duì)更嚴(yán)重甚至致死性缺血或缺氧的耐受性。HPC是機(jī)體抗缺氧或缺血的一種內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象，可發(fā)生在腦、心、肺、肝和腎等組織，其中腦HPC由Kitagawa等于1990年首報(bào)道，此保護(hù)現(xiàn)象為臨床治療腦缺血/低氧性損傷提供了新思路［1］。此后大量實(shí)驗(yàn)及我實(shí)驗(yàn)室前期工作表明，HPC能改善以后出現(xiàn)的腦缺氧缺血［2-3］。若預(yù)先多次給于人體能耐受的低氧條件，則可明顯減少缺血性腦卒中的發(fā)病率、死亡率和致殘率。目前，腦低氧預(yù)處理的機(jī)制尚不十分清楚，尤其是其細(xì)胞保護(hù)的信號(hào)通路、分子機(jī)制還需要深入研究。本實(shí)驗(yàn)以PC12細(xì)胞為對(duì)象，從不同層面對(duì)HPC抗腦缺氧缺血的機(jī)制進(jìn)行研究，探索自噬在其中的作用。

材料和方法

1材料

PC12細(xì)胞株由上海中科院典型細(xì)胞培養(yǎng)庫提供; DMEM培養(yǎng)液和新生牛血清購于HyClone; 3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)購于Sigma;細(xì)胞存活與毒性檢測(cè)試劑盒CCK-8、caspase-3活性檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗LC3-Ⅱ多克隆抗體購自Abcam;兔抗beclin-1多克隆抗體購自Bioworld;兔抗cleaved-caspase-3單克隆抗體購自Abgent;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+ L)購自Laboratories;蛋白Marker購自Fermentas。

2主要方法

2.1PC12細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞置于10%胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)中，在37℃、5% CO2的飽和水汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h換培養(yǎng)液，當(dāng)單層細(xì)胞融合后，行傳代處理。傳代后隨機(jī)分為對(duì)照(control)組、HPC組、3-MA組、HPC+氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)組、3-MA+ HPC+ OGD組和OGD組。每次每組設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2PC12細(xì)胞低氧預(yù)處理模型的建立每天定時(shí)將PC12細(xì)胞移至37℃恒溫密閉容器內(nèi)，連續(xù)充以低氧氣體(93% N2、2% O2、5% CO2)，30 min后立即取出，再恢復(fù)常氧培養(yǎng)，重復(fù)6次，建立細(xì)胞低氧預(yù)處理模型。

2.3PC12細(xì)胞OGD模型的建立選用培養(yǎng)6 d生長良好的PC12細(xì)胞，置換成無糖培養(yǎng)基孵育，放入

37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h(94% N2、1% O2、5% CO2)，然后復(fù)氧復(fù)糖培養(yǎng)24 h。

2.4CCK-8比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，以2×104/L接種于96孔板，每孔細(xì)胞懸液100 μL。在37℃、5% CO2的飽和水汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。處理后，每孔加10 μL CCK-8溶液，避光孵育2 h，酶標(biāo)儀在波長450 nm處讀取吸光度(A)值，用8個(gè)復(fù)孔A值的均數(shù)計(jì)算存活率。存活率按下式計(jì)算:存活率=A處理/A對(duì)照×100%。本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的細(xì)胞存活率定為100%。

2.5Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)caspase-3酶活性冰浴裂解細(xì)胞15 min，4℃、20 000×g離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移到96孔板中。配置反應(yīng)體系，再加入Ac-DEVD-pNA后混勻，37℃孵育60 min，測(cè)定A405。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比計(jì)算出樣品中催化產(chǎn)生多少量的pNA。

2.6一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)凋亡取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，以5×105/L接種于24孔板內(nèi)載玻片上，每個(gè)孔細(xì)胞懸液500 μL;培養(yǎng)24 h后，分組處理細(xì)胞;棄培養(yǎng)液、PBS洗滌1次、4%多聚甲醛固定1 h、0.1% Triton X-100冰浴孵育5 min、在樣品上加50 μL TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育60 min，封片后立即在熒光顯微鏡下觀察。在100倍鏡下，隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)呈現(xiàn)綠色熒光的凋亡細(xì)胞，取平均值，計(jì)算細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/視野下細(xì)胞總數(shù)×100%，重復(fù)3次。

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率PC12細(xì)胞經(jīng)分組處理后，PBS洗2遍，收集104個(gè)細(xì)胞，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻。室溫(20～25℃)避光孵育10～20 min，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.8Western blot法檢測(cè)caspase-3、LC3-Ⅱ和beclin-1的蛋白水平收獲細(xì)胞，4℃預(yù)冷的PBS洗1次，加入適量的細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，低溫離心機(jī)12 000×g離心10 min，取上清液，棄沉淀。用BCA法測(cè)定各組蛋白含量，每孔上樣25 μL蛋白，經(jīng)15% SDS-PAGE 80V分離2 h后，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜40 min，5%脫脂牛奶常溫下封閉1 h后，在4℃孵育I抗(兔抗大鼠LC-3滴度為1∶1 000，兔抗大鼠bec-lin-1滴度為1∶1 500，兔抗大鼠cleaved caspase-3抗體滴度為1∶1 000，小鼠抗大鼠β-actin滴度為1∶3 000) ; 5%脫脂牛奶常溫下封閉; II抗(羊抗兔辣根過氧化物酶IgG和羊抗小鼠辣根過氧化物酶IgG滴度均為1∶5 000，5%脫脂牛奶配制)孵育，ECL顯影顯示目的條帶和內(nèi)參照。用ImageJ軟件分析光密度值，Sigma Plot 13軟件分析蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)(SNK-q檢驗(yàn))。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1不同處理組PC12細(xì)胞的形態(tài)觀察

倒置相差光學(xué)顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞形態(tài)的變化，正常PC12細(xì)胞大部分呈梭形，少數(shù)呈多邊形，多數(shù)可見細(xì)胞突起，折光性好，貼壁能力強(qiáng); OGD處理后，細(xì)胞貼壁數(shù)量明顯減少，細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)閳A形，體積皺縮，突起減少或消失，折光性減弱，脫壁的細(xì)胞增加; HPC+ OGD組細(xì)胞的缺氧缺糖損傷明顯減輕; 3-MA+ HPC+ OGD組細(xì)胞的損傷無明顯減輕，見圖1。這提示HPC能減輕OGD引起的細(xì)胞損傷;自噬阻斷劑3-MA可阻斷這種保護(hù)作用。

Figure 1.The effect of different treatment factors on the morphology of PC12 cells (×100).圖1不同處理因素對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

2不同處理因素對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果以空白對(duì)照組細(xì)胞存活率為100.0%，則HPC、3-MA、HPC+ OGD、3-MA+ HPC+ OGD和OGD組存活率分別為98.7%、97.9%、86.2%、63.5%和67.6%。HPC+ OGD、3-MA+ HPC+ OGD組、OGD組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) ; HPC+ OGD組與3-MA+ HPC+ OGD組及OGD組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

3不同處理因素對(duì)PC12細(xì)胞caspase-3酶活性的影響

Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果以空白對(duì)照組細(xì)胞的caspase-3酶活性為1，則HPC、3-MA、HPC+ OGD、3-MA+ HPC+ OGD和OGD組的caspase-3酶活性分別為1.15、1.09、2.56、3.38和3.42。HPC+ OGD、3-MA+ HPC+ OGD組、OGD組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) ; HPC+ OGD組與3-MA+ HPC+ OGD組及OGD組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

Figure 2.The effect of different treatment factors on the cell viability of PC12 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs OGD group;△P＜0.05 vs 3-MA+ HPC+ OGD group.圖2不同處理因素對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響

Figure 3.The caspase-3 activity in the PC12 cells with different treatments.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs OGD group;△P＜0.05 vs 3-MA+ HPC+ OGD group.圖3各組細(xì)胞caspase-3酶活性的比較

4 TUNEL法熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

TUNEL熒光染色可見control組、HPC組和3-MA組陽性凋亡細(xì)胞數(shù)較少; HPC+ OGD組、3-MA+ HPC+ OGD組及OGD組陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多; HPC+ OGD組明顯低于3-MA+ HPC+ OGD組及OGD組(P＜0.05)，見圖4。

Figure 4.The TUNEL staining and apoptotic rate in the PC12 cells with different treatments (×100).Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs OGD group;△P＜0.05 vs 3-MA+ HPC+ OGD group.圖4各組細(xì)胞的TUNEL熒光染色及凋亡率的比較

5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示control組、HPC組、HPC+ OGD組和OGD組的凋亡率分別為(3.40±0.36) %、(3.87±0.59) %、(18.67±0.97) %和(36.40±0.89) %;與正常對(duì)照組相比，HPC+ OGD組和OGD組凋亡率明顯增加(P＜0.05)，HPC+ OGD組與OGD組比較明顯減少(P＜0.05)，見圖5。

Figure 5.Apoptosis of PC12 cells detected by flow cytometry of Annexin V-FITC/PI staining.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs OGD group.圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

6 Western blot法檢測(cè)caspase-3、LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白水平的變化

蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，HPC+ OGD組和OGD組的cleaved caspase-3的蛋白量均增加(P＜0.05) ;且HPC+ OGD組明顯低于OGD組(P＜0.05)。HPC+ OGD組的LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白表達(dá)明顯高于OGD組(P＜0.05)，見圖6。

Figure 6.The protein levels of cleaved caspase-3，LC3-Ⅱand beclin-1 in the PC12 cells with different treatments.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs OGD group.圖6各組PC12細(xì)胞cleaved caspase-3、LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白水平的比較

討論

自噬是指存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象，細(xì)胞在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新［4］。自噬是繼壞死、凋亡后發(fā)現(xiàn)的第3種細(xì)胞死亡形式，參與了如腦損傷等多種疾病的發(fā)病過程［4］。細(xì)胞在受到外界因素刺激，如饑餓、缺氧、高溫、應(yīng)激等逆境條件下均可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，可以在一定程度上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)［5-6］。自噬在機(jī)體的生命過程中隨處可見，但是其關(guān)鍵的發(fā)生和作用機(jī)制尚未完全闡明［7］。盡管自噬現(xiàn)象很早就被發(fā)現(xiàn)，但對(duì)自噬與腦缺氧缺血關(guān)系的研究時(shí)間并不長。目前，大多數(shù)研究證實(shí)自噬具有腦保護(hù)作用。Erlich等［8］采用雷帕霉素干預(yù)大鼠顱腦損傷也發(fā)現(xiàn)了自噬現(xiàn)象的產(chǎn)生，證明顱腦損傷后4 h注入雷帕霉素在腦功能恢復(fù)上與未注入組有明顯改善效果。Carloni等［9］研究結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡與自噬存在負(fù)相關(guān)，自噬激動(dòng)劑雷帕霉素的使用加速后自噬現(xiàn)象的發(fā)生，減少細(xì)胞凋亡，減輕腦損傷;說明自噬激活在腦損傷早期，可能對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起著一定的保護(hù)作用。Zhang等［10］證明腦外傷后確實(shí)激活了細(xì)胞自噬的發(fā)生，且能夠維持32天，自噬在損傷后早期主要保護(hù)周圍神經(jīng)細(xì)胞免于凋亡和退行性變，并在神經(jīng)細(xì)胞損傷與修復(fù)過程中長期發(fā)揮生物學(xué)作用。Komatsu等［11］的研究表明一定程度自噬具有增強(qiáng)抗氧化、恢復(fù)認(rèn)知功能、調(diào)節(jié)腦血流量等特異的作用。當(dāng)神經(jīng)元遭遇應(yīng)激時(shí)，自噬最先被激活，當(dāng)自噬不能維持神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)后，細(xì)胞再繼發(fā)凋亡，最后進(jìn)入壞死;且自噬與凋亡可同時(shí)存在于神經(jīng)元細(xì)胞，推測(cè)自噬參與腦缺氧缺血后神經(jīng)元的保護(hù)［12-13］。事實(shí)上，自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，主要由自噬相關(guān)基因編碼的蛋白來完成相應(yīng)的生物學(xué)功能。LC3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母ATG8(Aut7/Apg8)基因的同源物，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的形成。LC3有Ⅰ型和Ⅱ型之分，未發(fā)生自噬時(shí)，細(xì)胞內(nèi)合成的LC3經(jīng)過加工，成為胞質(zhì)可溶性的LC3-Ⅰ，常規(guī)表達(dá)。當(dāng)自體吞噬發(fā)生時(shí)，LC3-Ⅰ經(jīng)泛素樣加工修飾過程，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ結(jié)合并始終位于胞內(nèi)自噬體的膜上，其含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少成正比。因此LC3-Ⅱ是目前觀察自噬現(xiàn)象是否存在、研究自噬活性較為可靠的生物學(xué)標(biāo)志物［14］。Beclin-1是激活自噬的上游信號(hào)分子，游離的beclin-1能與多種蛋白質(zhì)共同形成Ⅲ型PI3K復(fù)合體，參與早期自噬體的形成。已經(jīng)證實(shí)通過上調(diào)beclin-1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)能夠刺激自噬的發(fā)生［15］。因此，常以beclin-1的表達(dá)來衡量自噬的發(fā)生。

凋亡是由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡的一種過程。Caspase是一大類凋亡調(diào)控基因，對(duì)神經(jīng)元的凋亡起著非常關(guān)鍵的作用，而caspase-3被稱為死亡蛋白酶，是caspase家族中最重要的細(xì)胞凋亡執(zhí)行者之一［16］。腦組織缺血、缺氧后，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)能量代謝發(fā)生障礙，產(chǎn)生大量氧自由基、興奮性氨基酸及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激素等，均可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。值得注意的是，細(xì)胞自噬是一把雙刃劍。一方面，自噬的過度激活可能介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡的發(fā)生［17-18］;另一方面，自噬的啟動(dòng)也有助于維持神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)，減少繼發(fā)損傷，并有效清除已經(jīng)被損傷的細(xì)胞器而對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用［19］。有報(bào)道稱低氧預(yù)處理可誘導(dǎo)自噬，自噬可能參與神經(jīng)保護(hù)作用［20］。那么在PC12細(xì)胞OGD損傷過程中自噬扮演什么角色?在HPC的影響下，自噬能否被激活?細(xì)胞自噬的增強(qiáng)能否對(duì)更嚴(yán)重的缺氧缺血起到保護(hù)作用?檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)未見相關(guān)報(bào)道。

本研究CCK-8結(jié)果表明，OGD組細(xì)胞存活率顯著降低，HPC+ OGD組細(xì)胞存活率顯著高于OGD組，3-MA+ HPC+ OGD組顯著低于HPC+ OGD組。這提示HPC明顯增加OGD導(dǎo)致的PC12細(xì)胞存活率降低，具有保護(hù)作用;且可被自噬抑制劑3-MA阻斷。通過caspase-3酶活性檢測(cè)顯示，OGD組caspase-3酶活性顯著升高，HPC+ OGD組的caspase-3酶活性顯著低于OGD組，且3-MA+ HPC+ OGD組顯著高于HPC+ OGD組。提示HPC明顯降低OGD導(dǎo)致PC12細(xì)胞caspase-3酶活性升高，具有保護(hù)作用;且可被自噬抑制劑3-MA阻斷。通過TUNEL熒光染色檢測(cè)法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率顯示，與正常對(duì)照組相比，OGD組細(xì)胞凋亡率明顯增多，HPC+ OGD組明顯低于3-MA+ HPC+ OGD組及OGD組。提示HPC明顯降低了OGD導(dǎo)致的PC12細(xì)胞凋亡率，具有保護(hù)作用，與相關(guān)研究結(jié)果基本相符［21-22］，且這種保護(hù)效應(yīng)可被自噬抑制劑3-MA阻斷。我們進(jìn)一步通過Western blot對(duì)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3及自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、beclin-1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HPC+ OGD組、OGD組的激活型caspase-3蛋白量均增加，且HPC+ OGD組明顯低于OGD組。HPC組及HPC+ OGD組LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白表達(dá)明顯高于OGD組。說明細(xì)胞自噬的激活在一定程度上可對(duì)抗凋亡，LC3-Ⅱ及beclin-1蛋白的調(diào)控和caspase-3活化存在負(fù)相關(guān)。因此，我們推測(cè)HPC誘導(dǎo)自噬的激活，可對(duì)抗神經(jīng)元的氧糖剝奪損傷，延緩細(xì)胞凋亡過程的發(fā)生，對(duì)細(xì)胞存活起一定的保護(hù)作用［23］。研究低氧預(yù)處理啟動(dòng)和調(diào)控自噬的激活，或許能夠?yàn)閼?yīng)對(duì)神經(jīng)元損傷提供新的策略，為腦缺血的防治開辟新的途徑，既有理論意義，又有潛在的臨床應(yīng)用前景。

［參考文獻(xiàn)］

［1］Ara J，F(xiàn)ekete S，F(xiàn)rank M，et al.Hypoxic-preconditioning induces neuroprotection against hypoxia-ischemia in newborn piglet brain［J］.Neurobiol Dis，2011，43(2) : 473-485.

［2］Zhang N，Yin Y，Han S，et al.Hypoxic preconditioning induced neuroprotection against cerebral ischemic injuries and its cPKC-gamma-mediated molecular mechanism［J］.Neurochem Int，2011，58(6) : 684-692.

［3］Sun HS，Xu B，Chen W，et al.Neuronal K(ATP) channels mediate hypoxic preconditioning and reduce subsequent neonatal hypoxic-ischemic brain injury［J］.Exp Neurol，2015，263: 161-171.

［4］Shpcilka T，Elazar Z.Shedding light on mammalian microautophagy［J］.Dev Cell，2011，20(1) : 1-2.

［5］Zou W，Wang X，Vale R，et al.Autophagy genes promote apoptotic cell corpse clearance［J］.Autophagy，2012，8(8) : 34-38.

［6］Luo J.Autophagy and ethanol neurotoxicity［J］.Autophagy，2014，10(12) : 2099-2108.

［7］Aveleira CA，Botelho M，Carmo-Silva S，et al.Neuropeptide Y stimulates autophagy in hypothalamic neurons［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2015，112 (13) : E1642-E1651.

［8］Erlich S，Alexandrovich A，Shohami E，et al.Rapamycin is a neuroprotective treatment for traumatic brain injury ［J］.Neurobiol Dis，2007，26(1) : 86-93.

［9］Carloni S，Buonocore G，Balduini W.Protective role of autophagy in neonatal hypoxia-ischemia induced brain injury［J］.Neurobiol Dis，2008，32(3) : 329-339.

［10］Zhang YB，LI SX，Chen XP，et al.Autophagy is activated and might protect neurons from degeneration after traumatic brain injury［J］.Neurosci Bull，2008，24(3) : 143-149.

［11］Komatsu M，Waguri S，Chiba T，et al.Loss of autophagy in the central nervous system causes neurodegeneration in mice［J］.Nature，2006，441(7095) : 880-884.

［12］Wang P，Guan YF，Du H，et al.Induction of autophagy contributes to the neuroprotection of nicotinamide phosphoribosyltransferase in cerebral ischemia［J］.Autophagy，2012，8(1) : 77-87.

［13］Yamamoto A，Yue Z.Autophagy and its normal and pathogenic states in the brain［J］.Annu Rev Neurosci，2014，37: 55-78.

［14］Mehrpour M，Esclatine A，Beau I，et al.Overview of macro-autophagy regulation in mammalian cells［J］.Cell Res，2010，20(7) : 748-762.

［15］Gabryel B，Kost A，Kasprowska D.Neuronal autophagy in cerebral ischemia is a potential target for neuroprotective strategies［J］.Pharmacol Rep，2012，64(1) : 1-15.

［16］Jan CR，Su JA，Teng CC，et al.Mechanism of maprotiline-induced apoptosis: role of［Ca2+］i，ERK，JNK and caspase-3 signaling pathways［J］.Toxicology，2013，304: 1-12.

［17］Adhami F，Liao G，Morozov YM，et al.Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy ［J］.Am J Pathol，2006，169(2) : 566-583.

［18］Balduini W，Carloni S，Buonocore G，et al.Autophagy in hypoxia-ischemia induced brain injury［J］.J Matern Fetal Neonatal Med，2012，25 Suppl 1: 30-34.

［19］Zhao Y，Chen G，Zhang W，et al.Autophagy regulates hypoxia-induced osteoclastogenesis through the HIF-1α/BNIP3 signaling pathway［J］.J Cell Physiol，2012，227 (2) : 639-648.

［20］Tzeng YW，Lee LY，Chao PL，et al.Role of autophagy in protection afforded by hypoxic preconditioning against MPP+-induced neurotoxicity in SH-SY5Y cells［J］.Free Radic Biol Med，2010，49(5) : 839-846.

［21］周天恩，張萌，楊正飛，等.亞低溫減輕氧糖剝奪所致的大鼠海馬神經(jīng)元損傷［J］.中國病理生理雜志，2013，29(7) : 1165-1170.

［22］Cui C，Zhou T，Li J，et al.Proteomic analysis of the mouse brain after repetitive exposure to hypoxia［J］.Chem Biol Interact，2015，236: 57-66.

［23］Sarkar C，Zhao Z，Aungst S，et al.Impaired autophagy flux is associated with neuronal cell death after traumatic brain injury［J］.Autophagy，2014，10(12) : 2208-2222.

(責(zé)任編輯:林白霜，余小慧)

Hypoxic preconditioning alleviates oxygen-glucose deprivation in PC12 cells: the involvement of autophagy

LU Na，WEI Lin-yu，WANG Bao-ying，LI Xin-juan，LI Chao-kun，BAI Rui-ying，LI Dong-liang
(Department of Physiology and Neurobiology，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003，China.E-mail: 13462225817@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To examined the effects of hypoxic preconditioning (HPC) on oxygen-glucose deprivation (OGD) -induced PC12 cells，and to investigate its possible mechanisms of autophagy.METHODS: Cultured PC12 cells were randomly divided into control group，HPC group，3-methyladenine (3-MA) group，HPC+ OGD group，3-MA+ HPC+ OGD group and OGD group.CCK-8 assay was used to detect the cell viability.The caspase-3 activity was also tested.TUNEL staining and flow cytometry were used to detect the cell apoptosis.The protein levels of apoptosis-related protein caspase-3 and autophagy-marked protein LC3-2 and beclin-1 were determined by Western blot.RESULTS: Compared with control group，the viability of PC12 cells was significantly reduced，and the activity of caspase-3 was significantly increased in OGD group.Compared with 3-MA+ HPC+ OGD group and OGD group，the viability of PC12 cells was significantly increased，and the activity of caspase-3 was significantly reduced in HPC+ OGD group (P＜0.05).The PC12 cell injury was apparent after OGD with a great increase in the apoptotic rate (P＜0.05).Compared with OGD group，the apoptotic rate significantly decreased in HPC+ OGD group (P＜0.05).Compared with control group，the protein level of cleaved caspase-3 was significantly increased in OGD group (P＜0.05).Compared with OGD group，the protein level of cleaved caspase-3 was significantly decreased，and the levels of LC3-2 and beclin-1 were significantly increased in HPC+ OGD group (P＜0.05).CONCLUSION: OGD decreases cell survival and induces apoptosis.Activation of cell autophagy may be the mechanism by which hypoxic preconditioning protects the PC12 cells from OGD induced injury.

［KEY WORDS］Autophagy; Apoptosis; Hypoxic preconditioning; Oxygen-glucose deprivation

通訊作者△Tel: 0373-3029104; E-mail: 13462225817@163.com

*［基金項(xiàng)目］河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No.14A310009; No.14A310019)

［收稿日期］2015-03-27

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)09-1627-06

［中圖分類號(hào)］R363.21

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.017