PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮通過抑制炎癥反應(yīng)減輕肝移植大鼠圍術(shù)期腸損傷*

程 楠， 池信錦△， 李 璽， 葛 緬， 高婉菱， 黑子清

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1麻醉科，2甲乳外科，廣東廣州510630)

肝移植手術(shù)是治療終末期肝病的外科手段，因其手術(shù)復(fù)雜，術(shù)中需阻斷肝門靜脈和下腔靜脈，并存在血流動(dòng)力學(xué)障礙和缺血再灌注損傷，腸道是受損傷的重要靶器官，腸道黏膜損傷后可以激活一系列瀑布反應(yīng)，導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)的過度釋放，引發(fā)和加重失控性炎癥反應(yīng)綜合征，而全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)的發(fā)生更加重腸道損傷，引起惡性循環(huán)［1］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)屬于核受體超家族，是依賴配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控多種炎癥介質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄而具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用［2］。目前，PPARγ在肝移植圍術(shù)期炎癥反應(yīng)中的作用及對(duì)腸黏膜的影響尚不明確。本研究擬通過建立大鼠原位自體肝移植(orthotopic autologous liver transplantation，OALT)模型，觀察PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮對(duì)肝移植圍術(shù)期炎癥反應(yīng)的影響及腸損傷的作用，并初步探討其機(jī)制。

材料和方法

1 材料

健康雄性SD大鼠(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);羅格列酮(Cayman);二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)測試盒(武漢優(yōu)爾生公司);腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA 檢測試劑盒和白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)ELISA檢測試劑盒(南京凱基);脂肪酸結(jié)合蛋白2(fatty acid-binding protein 2，F(xiàn)ABP2)檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生公司)。

2 分組

健康雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只:(1)對(duì)照(control)組:靜脈注射等量的生理鹽水;(2)假手術(shù)(sham)組:麻醉后開腹，分離肝門，余不作進(jìn)一步處理;(3)OALT組:建立原位自體肝移植模型;(4)羅格列酮預(yù)處理(ROS+OALT)組:建立原位自體肝移植模型前30 min經(jīng)尾靜脈靜脈注射羅格列酮(0.3 mg/kg)，其余操作同OALT組。

3 方法

3.1 自體原位肝移植動(dòng)物模型的建立 大鼠于術(shù)前常規(guī)禁食12 h，自由飲水;采用我們以前報(bào)道的方法，建立SD大鼠自體原位肝移植模型［3］，分別在肝臟再灌注后8 h處死大鼠時(shí)取材，對(duì)照組在麻醉后只進(jìn)行開腹和血管的分離，不進(jìn)行肝臟的阻斷和灌注。8 h后處死大鼠，采集動(dòng)脈血4 mL，2 000 r/min離心15 min，－70℃保存待測。

3.2 標(biāo)本采集 在肝臟再灌注后8 h處死大鼠時(shí)取材。經(jīng)腹主動(dòng)脈抽取血液，離心后取上清液待測。留取部分末端回腸組織，冰鹽水沖洗干凈后，一部分放入10%多聚甲醛中，用于石蠟包埋，其余小腸組織迅速放入液氮中保存，待測。

3.3 腸組織病理學(xué)檢測 多聚甲醛固定腸組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀用于小腸黏膜光鏡病理觀察。腸黏膜病理變化采用Chiu’s評(píng)分法［4］進(jìn)行評(píng)分:正常黏膜絨毛結(jié)構(gòu)為0分;上皮下間隙增大，通常在絨毛的尖端常伴隨有毛細(xì)血管淤血為1分;上皮下間隙擴(kuò)張伴隨上皮層同固有層的中度分離為2分;絨毛兩側(cè)上皮層大量的同固有層分離，部分絨毛頂端破損為3分;絨毛破損伴隨固有層毛細(xì)血管暴露，可能觀察到固有層的細(xì)胞成分增多為4分;固有層破壞和不完整，出血和潰瘍?yōu)?分。

3.4 血清DAO和FABP2含量的測定 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

3.5 Western blot法檢測PPARγ蛋白含量 準(zhǔn)確稱取腸組織0.01 g，制成10%的腸組織勻漿，離心取上清，并按照考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量后，保存于－20℃待測。對(duì)蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜。5%脫脂牛奶封閉過夜。分別加入兔稀釋度1∶1 000的待測Ⅰ抗(Santa Cruz)和稀釋度為1∶1 000的 β-actinⅠ抗(Santa Cruz)，再加稀釋度為1∶2 000的相應(yīng)Ⅱ抗(Santa Cruz)。以 β-actin為內(nèi)參照，用Gel-Pro Analyzer分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值數(shù)字化并計(jì)算相對(duì)灰度值。

3.6 免疫熒光法檢測磷酸化NF-κB p65亞基的核轉(zhuǎn)運(yùn)激活情況 石蠟切片常規(guī)脫蠟后，置于枸櫞酸抗原修復(fù)液中微波加熱后自然降溫，PBS沖洗。切片于3% 過氧化氫10 min，蒸餾水沖洗。滴加兔來源的 NF-κB p65Ⅰ抗(1∶250，Santa Cruz)，將切片置濕盒中4℃ 過夜，PBS沖洗。滴加FITC羊抗兔IgGⅡ抗，室溫避光2 h。PBS沖洗，待玻片晾干用含DAPI的抗熒光淬滅封片劑封片，ZEISS LSM510 META激光共聚焦顯微鏡下觀察各組Nrf2核內(nèi)表達(dá)。

3.7 腸組織中IL-6和TNF-α檢測 準(zhǔn)確稱取回腸組織0.01 g，加9倍生理鹽水制成10%的腸組織勻漿，離心后取上清液，采用BCA法測定蛋白含量，然后嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件處理。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用最小顯著差法(LSD法)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腸黏膜光鏡病理變化

對(duì)照組和假手術(shù)組黏膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，結(jié)構(gòu)基本正常。OALT組腸黏膜上皮與固有層分離，部分上皮出現(xiàn)空泡、壞死及脫落。ROS+OALT組損傷較OALT組減輕，大多表現(xiàn)為上皮下間隙的擴(kuò)大，少部分表現(xiàn)為絨毛結(jié)構(gòu)破壞，絨毛上皮和固有層的中度分離，見圖1。

Figure 1.The effect of rosiglitazone precondictioning on intestinalhistology in differentgroups(HE staining，×200).圖1 羅格列酮預(yù)處理對(duì)原位自體肝移植大鼠圍術(shù)期腸黏膜病理變化的影響

2 腸粘膜病理Chiu’s評(píng)分

與sham組相比，OALT及ROS+OALT組Chiu’s評(píng)分均明顯增高(P＜0.01);與OALT組相比，ROS+OALT組Chiu’s評(píng)分均明顯降低(P＜0.01);對(duì)照組和 sham組相比 Chiu’s評(píng)分無明顯差別，見圖2。

Figure 2.The effect of rosiglitazone precondictioning on intestinal Chiu’s score in various groups.Mean±SD.n=10.＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs OALT group.圖2 羅格列酮預(yù)處理對(duì)原位自體肝移植大鼠圍術(shù)期小腸黏膜Chiu’s評(píng)分的影響

3 大鼠血清DAO和FABP2水平變化

與sham組相比，OALT組血清DAO和FABP2濃度均增高，ROS+OALT組血清FABP2濃度增高(P＜0.01);與OALT組相比，ROS+OALT組大鼠血清DAO和FABP2濃度均降低(P＜0.01)，見圖3。

4 大鼠腸組織PPARγ蛋白含量變化

與sham組相比，OALT組腸組織PPARγ蛋白含量增高(P＜0.01);與OALT組相比，ROS+OALT組腸組織 PPARγ蛋白含量明顯增高(P＜0.01)，見圖4。

Figure 3.The effect of rosiglitazone precondictioning on the serum concentrations of DAO and FABP2 in various groups.Mean±SD.n=10.＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs OALT group.圖3 羅格列酮預(yù)處理對(duì)大鼠原位自體肝移植大鼠圍術(shù)期血清DAO和FABP2水平變化的影響

Figure 4.Representative Western blot for the expression of PPARγ on intestine in different groups.Mean±SD.n=10.＊＊P ＜ 0.01 vs sham group;##P ＜ 0.01 vs OALT group.圖4 羅格列酮預(yù)處理對(duì)大鼠原位自體肝移植大鼠圍術(shù)期腸組織PPARγ蛋白含量變化的影響

5 NF-κB p65亞基的核轉(zhuǎn)位情況

如圖5所示，對(duì)照組和sham組腸黏膜未見明顯的NF-κB p65亞基核轉(zhuǎn)位;OALT組大鼠腸組織NF-κB p65亞基核轉(zhuǎn)位增加明顯，表明NF-κB激活明顯增加;術(shù)前給予羅格列酮預(yù)處理后，大鼠腸組織NF-κB p65核轉(zhuǎn)位明顯減弱。

Figure 5.The effect of rosiglitazone precondictioning NF-κB p65 nuclear translocation in the intestine in different groups(×400).圖5 羅格列酮預(yù)處理對(duì)原位自體肝移植大鼠圍術(shù)期腸黏膜NF-κB p65亞基轉(zhuǎn)位的影響

6 大鼠腸組織TNF-α和IL-6水平變化

與sham組相比，OALT組腸組織TNF-α和IL-6濃度增高(P＜0.01);與OALT組相比，ROS+OALT組大鼠腸組織TNF-α和IL-6濃度明顯降低(P＜0.01)，見圖 6。

Figure 6.The effect of rosiglitazone precondictioning on concentration of intestinal TNF-α and IL-6 in various groups.Mean±SD.n=10.＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs OALT group.圖6 羅格列酮預(yù)處理對(duì)原位自體肝移植大鼠圍術(shù)期腸組織TNF-α和IL-6水平變化的影響

討 論

有研究顯示［5］肝移植術(shù)后呈現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，肝移植術(shù)后SIRS的發(fā)生率為45%。腸道損傷是炎癥反應(yīng)的重要起點(diǎn)，我們以往的研究也顯示，肝移植圍術(shù)期會(huì)出現(xiàn)明顯的腸道損害，這可能會(huì)加重全身炎癥反應(yīng)［6］。我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)M了肝移植手術(shù)術(shù)中阻斷肝門及下腔靜脈造成的低血壓、腸系膜靜脈淤血、肝臟冷灌注和肝臟缺血再灌注這些復(fù)雜的病理生理化，結(jié)果顯示肝移植手術(shù)組大鼠的腸黏膜出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變，Chiu’s評(píng)分明顯升高;同時(shí)血清DAO和FABP2的濃度及腸組織炎癥介質(zhì)的含量也明顯增加，提示阻斷肝門部血流導(dǎo)致門脈系統(tǒng)所屬靜脈回流受阻，廣泛的腸系膜靜脈淤血，從而減慢小腸壁血流，導(dǎo)致腸黏膜發(fā)生淤血性缺血缺氧［7-8］和炎癥介質(zhì)釋放。

PPARγ是一種重要的配體激活核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，處于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的上游區(qū)域，能夠發(fā)揮拮抗轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的作用，減少多種細(xì)胞因子、黏附分子基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并借此影響炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展［9］。羅格列酮是高選擇性PPARγ激動(dòng)劑，可以在轉(zhuǎn)錄水平抑制多種促炎介質(zhì)的基因表達(dá)［10］。已有研究表明羅格列酮在心血管、肺部、胃腸道等重要臟器的急慢性炎性病變及全身炎癥反應(yīng)綜合癥中都發(fā)揮一定的抗炎作用［11］，以及PPARγ激動(dòng)劑在膿毒癥、失血性休克、腦缺血再灌注中的肺、腎和腦保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了在肝再灌注8 h腸道黏膜損傷最明顯這個(gè)時(shí)點(diǎn)觀察PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮預(yù)處理對(duì)腸組織PPARγ表達(dá)的影響和對(duì)腸黏膜的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，原位自體肝移植后腸組織病理學(xué)改變明顯和Chiu’s評(píng)分增高，OALT組大鼠血清DAO和FABP2的水平明顯升高。DAO是具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，主要由胃腸黏膜上皮細(xì)胞合成，當(dāng)黏膜細(xì)胞出現(xiàn)損傷或壞死時(shí)，DAO即從腸道組織釋放入血液，因此血清DAO是反映腸黏膜機(jī)械屏障完整性和損傷程度的敏感指標(biāo)［12］。FABP2是脂肪酸結(jié)合蛋白中超家族的重要成員，主要參與機(jī)體對(duì)脂肪酸的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)以及在細(xì)胞器內(nèi)的再分布及利用。近年研究表明，F(xiàn)ABP2與腸組織缺血損傷等密切相關(guān)，是腸組織損傷的敏感性標(biāo)志［13］。血清DAO和FABP2的增高說明炎癥反應(yīng)在腸缺血再灌注損傷中進(jìn)一步加重腸黏膜的損傷。

NF-κB是體內(nèi)廣泛存在的一種核轉(zhuǎn)錄因子，多種信號(hào)通路的關(guān)鍵下游，參與調(diào)控多種炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的表達(dá)［14］，參與機(jī)體炎癥分子表達(dá)調(diào)控。NF-κB持續(xù)活化引起炎癥介質(zhì)過度表達(dá)和釋放，是導(dǎo)致SIRS、膿毒癥等失控性炎癥反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵因素。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示羅格列酮預(yù)處理會(huì)上調(diào)自體肝移植圍術(shù)期大鼠腸組織PPARγ的表達(dá)，抑制NF-κB激活和炎癥介質(zhì)的釋放，從而減輕腸損傷，有助于維護(hù)腸黏膜的機(jī)械屏障功能。

本研究結(jié)果表明肝移植手術(shù)阻斷肝門靜脈和下腔靜脈，產(chǎn)生特殊的病理生理變化，激活了NF-κB炎癥因子信號(hào)通路，使腸道黏膜屏障受到損傷。PPARγ特異性激動(dòng)劑羅格列酮可以上調(diào)PPARγ的表達(dá)，抑制NF-κB的激活，減少炎癥因子的釋放，從而對(duì)肝移植圍術(shù)期腸黏膜具有保護(hù)作用。

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