橄欖苦苷對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞損傷的作用及機制研究*

戴 兵， 徐 俐， 金海東， 蔡寧宇， 陳 輝， 李 斌， 蔡建武， 潘 駿△

(1浙江中醫(yī)藥大學附屬溫州中醫(yī)院，2溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院骨科，浙江溫州325027)

骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以局灶性關節(jié)軟骨退行性病變、骨丟失、關節(jié)邊緣骨贅形成及關節(jié)畸形和軟骨下骨質(zhì)硬化為特征的慢性關節(jié)疾病，多見于中老年人，女性多于男性。當今尚未發(fā)現(xiàn)治療骨關節(jié)炎的滿意治療方法，一般都是僅僅給予對癥治療，臨床上應用最多的非甾體類抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)又常引起胃腸消化道出血以及心血管等諸多方面的副作用。研究報道天然植物化學物質(zhì)由于其安全、有效、經(jīng)濟、副作用小而具有遠大的應用前景，為治療炎癥如OA等，提供了新的方向［1］。國內(nèi)外流行病學研究發(fā)現(xiàn)，以食用橄欖油為主的人群，乳腺癌、胃癌、腸癌和及慢性炎癥疾病的發(fā)病率很低［2］。橄欖油存在大量酚類化合物，如橄欖苦苷(oleuropein，OL)，因為其具有降低血糖，減少動脈粥樣硬化［3］以及抗炎作用［4］引起相當大的關注。一些研究還表明，橄欖油酚類化合物具有強大的抗氧化活性［5］和防止氧介導的細胞損傷反應的作用［6］。在這些前人研究的基礎上，本研究通過研究橄欖苦苷對IL-1β誘導的大鼠關節(jié)軟骨細胞的影響，探討橄欖苦苷對關節(jié)軟骨的保護機制。

材料和方法

1 動物和材料

健康雄性2周齡SD大鼠8只，購自溫州醫(yī)科大學實驗動物中心，有關動物實驗的相關內(nèi)容通過了溫州醫(yī)科大學倫理委員會的審批。

橄欖苦苷購自Sigma;DMEM和胎牛血清購自Gibco;抗生素和抗真菌劑溶液購自Life Technologies;抗 COX2、p65、p-p65、IκBα 和 p-IκBα 抗體購自CST;抗iNOS和GAPDH抗體購自Bioworld Technology;NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所;PGE-2 ELISA試劑盒購自R＆D。所用引物由上海生工合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.The sequences of the primers

2 方法

2.1 大鼠關節(jié)軟骨細胞的分離培養(yǎng) 無菌操作下分離2周齡SD大鼠膝關節(jié)的軟骨，剔除周圍組織，將軟骨塊剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小;選用酶2步消化法獲得軟骨細胞，加入含10% 胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基吹打混勻后移入25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以后每3～4 d更換培養(yǎng)基，待細胞鋪滿瓶底80%以上，0.25%胰酶/0.1%EDTA 消化細胞，1 000 r/min離心5 min，按1∶3傳代培養(yǎng)。

2.2 蛋白多糖和Ⅱ型膠原的檢測 取第3代細胞，制成細胞爬片，待細胞長至70% ～80%，4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗。室溫1%阿爾新蘭溶液染色40 min，雙蒸水沖洗，自然干燥，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察細胞內(nèi)蛋白多糖的表達情況。

另取細胞爬片于3%H2O2中室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗;正常山羊血清工作液封閉，室溫孵育20 min，PBS沖洗;滴加I抗(1∶100稀釋)4℃孵育過夜，PBS沖洗;滴加 II抗工作液，37℃濕盒中孵育30 min，PBS沖洗;滴加DAB顯色1 min，PBS沖洗;蘇木素復染，流水沖洗30 min;封片，鏡下觀察Ⅱ型膠原的顯色情況。

2.3 橄欖苦苷對大鼠軟骨細胞活性的影響 取生長良好的第3代軟骨細胞，接種于96孔培養(yǎng)板，將培養(yǎng)板置于5%CO2培養(yǎng)箱;細胞培養(yǎng)3 d后，吸棄培養(yǎng)基，分別加入含藥物的 DMEM培養(yǎng)基(不含胎牛血清)200 μL，藥物的最終濃度分別為0 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L 和 100 μmol/L。培養(yǎng) 24 h后，小心吸去上清，按照說明書每孔加入CCK-8溶液10 μL，37℃避光孵育1 h。酶標儀上測定樣本450 nm的光吸收值(A)。計算每種藥物濃度組光吸收值的平均值，分別與空白對照組比較。

2.4 實驗分組 取第3代原代軟骨細胞進行實驗，實驗設空白對照(control)組(只加培養(yǎng)基)、IL-1β組(IL-1β 10 μg/L)、IL-1β +OL 組(其中，IL-1β 濃度為10 μg/L，橄欖苦苷分別為 10、50、100 μmol/L)。

2.5 細胞上清液中一氧化氮(nitric oxide，NO)和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)含量的測定 各組細胞加入不同劑量的橄欖苦苷干預2 h后加入IL-1β。將培養(yǎng)板置于37℃、5%C02培養(yǎng)箱。培養(yǎng)24 h后提取細胞培養(yǎng)孔內(nèi)的上清液，4℃、2 000 r/min離心5 min去除細胞碎片，輕輕吸取上清液，按照說明書在550 nm和0.5 cm光徑下測紫外分光光度計下各管吸光度值。NO含量=(測定管A值－空白管A值)/(標準管A值－空白管A值)×標準品濃度×樣品測試前稀釋倍數(shù)。

設置樣本組和標準品組，標準品孔各加50 μL不同梯度的標準品溶液;樣品組加10 μL上清液和40 μL稀釋液;樣本組和標準品組均加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μL，封板膜封板，37℃恒溫1 h;棄去上清液，加洗滌液洗滌，加入底物 A、B各 50 μL，37 ℃恒溫避光15 min;加入終止液50 μL/well，450 nm處測定A值。根據(jù)標準品求出標準方程，然后計算各組PGE2含量。

2.6 橄欖苦苷對軟骨細胞基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1和 MMP-13表達的影響 收集各組細胞，總RNA抽提按TRIzol試劑說明書操作，分光光度計測量RNA的純度及濃度，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green染色法，以各組cDNA為模板，加入緩沖液、引物等進行PCR，各樣本重復3次。反應條件如下:95℃ 2 min;95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃20 s，循環(huán)40 次。

2.7 橄欖苦苷對經(jīng)IL-1β誘導的SD大鼠軟骨細胞環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase 2，COX2)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)及核因子 κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路蛋白的影響冷的PBS洗滌細胞2遍，冰上裂解細胞、離心并收集上清后行蛋白定量，采用10%SDS-PAGE。蛋白分離后經(jīng)恒流電轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，使用含5%脫脂牛奶的封閉液室溫封閉1 h，與β2M抗體4℃孵育過夜后，次日加入II抗室溫孵育1h，TBST洗膜3次，取出膜后加入ECL發(fā)光液，移入凝膠成像分析儀中，化學光敏模式曝光顯影。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，3組以上的組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 軟骨細胞的鑒定

顯微鏡下見軟骨細胞貼壁生長，呈現(xiàn)三角形或不規(guī)則多角形。軟骨細胞經(jīng)過阿爾新藍染色后，可見蛋白多糖藍色顆粒。在Ⅱ型膠原免疫組織化學染色實驗中，細胞質(zhì)呈黃色，細胞核呈紫色，見圖1。

2 各濃度藥物對細胞活性的作用

在本研究所采用的藥物濃度范圍內(nèi)，3種藥物濃度對軟骨細胞的活性均無明顯抑制作用，與對照組相比差異不顯著，見圖2。

Figure 1.A:alcian blue staining(×100);B:type II collagen immunohistochemical staining(×40).圖1 軟骨細胞的鑒定

Figure 2.The effect of oleuropein on the cell viability in the chondrocytes was assessed by CCK-8 assay.Mean ±SD.n=3.圖2 橄欖苦苷對軟骨細胞活性的影響

3 橄欖苦苷對IL-1β誘導的軟骨細胞NO和PGE2的影響

大鼠關節(jié)軟骨細胞橄欖苦苷(0、10、50或100 μmol/L)預處理2 h 后，加入IL-1β(10 μg/L)刺激24 h，與無IL-1β刺激的對照組相比，NO和PGE2均有顯著增加(P＜0.01)。橄欖苦苷以濃度梯度依賴的方式抑制 IL-1β刺激引起的 PGE2的升高(P＜0.05)。此外，橄欖苦苷還能以濃度依賴方式抑制IL-1β刺激引起的NO的升高(P＜0.05)，見圖3。

4 橄欖苦苷對IL-1β誘導的軟骨細胞基質(zhì)金屬蛋白酶的影響

IL-1β作用下，與對照組相比，MMP-1和MMP-13 mRNA的表達量增加(P＜0.05)。橄欖苦苷預處理后，顯著抑制MMP-1和MMP-13在mRNA水平的表達且濃度越高抑制效果越顯著，不同濃度的橄欖苦苷組間具有明顯差異(P＜0.05)，見圖4。

5 橄欖苦苷對IL-1β誘導的軟骨細胞COX-2和iNOS蛋白表達的影響

Figure 3.The effect of oleuropein(OL)on NO and PGE2productions in the chondrocytes with different treatments.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.圖3 橄欖苦苷對NO和PGE2的影響

COX-2和iNOS蛋白的表達通過Western blotting測定，結(jié)果如圖顯示，IL-1β可以促進軟骨細胞合成COX-2和iNOS，而橄欖苦苷可以抑制COX-2和iNOS蛋白表達的上調(diào)，見圖5。

6 橄欖苦苷抑制NF-κB的激活

NF-κB的通路活化在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮主要作用，可以上調(diào) COX-2和iNOS的表達。IL-1β刺激后，可以激活NF-κB信號通路，磷酸化并降解IκBα。同時，我們發(fā)現(xiàn)NF-κB p65亞基在細胞核中表達增加而在細胞質(zhì)表達下降。相反，預處理橄欖苦苷(10、50、100 μmol/L)后可以抑制 IκBα 磷酸化和p65亞基從細胞質(zhì)遷移到細胞核，見圖6。

討 論

白細胞介素(interleukin，IL)是由白細胞分泌的一類調(diào)節(jié)細胞生長與分化的因子，家族十分龐大，如今己被發(fā)現(xiàn)并命名的就高達33種?，F(xiàn)在己知的和軟骨損傷有關的白細胞介素因子有IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17 等，其中的 IL-1 的亞型 IL-1β是最基本的因素。已有證據(jù)表明，IL-1β能夠影響關節(jié)軟骨細胞的基質(zhì)的合成，在整個OA病變中發(fā)揮的重要作用［7］。IL-1β是一種主要的關節(jié)組織結(jié)構退變的代謝調(diào)節(jié)因子［8］，與軟骨破裂，基質(zhì)降解密切相關。它可以上調(diào)iNOS、COX-2、PGE2和 IL-6等炎癥因子和軟骨退變相關基因的表達［9］。

Figure 4.The mRNA expression of MMP-1 and MMP-13 in the chondrocytes with different treatments determined by real-time PCR analysis.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control group.圖4 MMP-1和MMP-13的real-time PCR檢測結(jié)果

IL-1β可以激活NO和PGE2的生成和釋放，導致一系列細胞因子的變化，引起OA的發(fā)生發(fā)展，是促成骨關節(jié)病一個關鍵的原因［10］。NO是一種短期效應的信號分子，它可以誘導細胞凋亡，還能強烈地抑制軟骨細胞合成蛋白聚糖，使軟骨的胞外基質(zhì)結(jié)構解離，無法維持正常的形態(tài)和功能。目前，已經(jīng)確定的NOS有神經(jīng)元型NOS(neuronal NOS，nNOS)、內(nèi)皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)和iNOS 3種。iNOS是NOS的誘導型，在關節(jié)軟骨中起作用的主要是iNOS，它容易被激活產(chǎn)生大量的NO而造成關節(jié)軟骨的損傷。研究表明在OA發(fā)生發(fā)展過程中，iNOS對NO的合成及其生物功能的發(fā)揮具有重要意義，體外實驗中NO、iNOS在骨關節(jié)液、血清中均有明顯表達，關節(jié)液、血清中NO、iNOS水平顯著高于正常組［11］，多項研究表明使用iNOS抑制劑能明顯減輕OA軟骨的損傷程度［12-13］.在本研究中，我們證明了橄欖苦苷能有效抑制關節(jié)炎軟骨細胞NO的產(chǎn)生及iNOS在蛋白水平的表達，這與Zhang等［14］的研究結(jié)果一致。

Figure 5.The protein expression of COX-2 and iNOS in the chondrocytes with different treatments determined by Western blotting.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control group.圖5 COX-2和iNOS的Western blotting結(jié)果

IL-1β促進滑膜細胞、軟骨細胞合成并釋放的PGE2和膠原酶產(chǎn)生強大的促炎癥作用［15］。前列腺素在化學本質(zhì)上是一種脂肪酸，是由COXs合成的前列素類化合物，COX-2是最可能引起關節(jié)炎中PGE2水平上升的相關酶類［16］。在生理功能上PGE2可以是一種炎癥介質(zhì)或是一種局部激素，引起滑膜炎癥和骨的吸收。PGE2含量的改變將導致關節(jié)間的多種組織的基質(zhì)合成發(fā)生改變。特別是促進骨吸收的作用最強，可激活破骨細胞，破壞骨與軟骨，且可激惹血管新生，在關節(jié)炎病理及關節(jié)破壞中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠關節(jié)軟骨細胞體外培養(yǎng)過程中，加入IL-1β的細胞上清液中PGE2的濃度明顯高于對照組，提示IL-1β能夠明顯提高PGE2的含量，加重對軟骨細胞的損害。再次證實IL-1β在OA軟骨細胞的破壞、OA的炎癥反應產(chǎn)生PGE2的過程中起了重要作用。同時，橄欖苦苷能以濃度依賴方式減少IL-1β刺激引起的PGE2的升高以及COX-2在蛋白水平的表達。

Figure 6.The effect of oleuropein on the protein levels of the molecules in the NF-κB signaling pathway in the chondrocytes with different treatments.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control group.圖6 NF-κB通路相關蛋白Western blotting結(jié)果

IL-1β可引起膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶解素等各種MMP的酶原合成、分泌及其活性增加，導致軟骨基質(zhì)降解來實現(xiàn)對關節(jié)軟骨細胞分解代謝的影響［17-19］，尤其是增加 MMP-1和 MMP-13等的合成，打破了基質(zhì)金屬蛋白酶-金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)的平衡，從而促進基質(zhì)大分子降解［20-21］。本研究用10 μg/L IL-1β誘導，通過real-time PCR技術檢測發(fā)現(xiàn)MMP-1和MMP-13的表達量明顯增加。在此基礎上，將橄欖苦苷作用于 IL-1β誘導的軟骨細胞，發(fā)現(xiàn) MMP-1、MMP-3和MMP-13的表達量明顯下降，揭示了橄欖苦苷對OA軟骨細胞的保護作用。

NF-κB 在炎癥過程中發(fā)揮重要作用［22］。NF-κB通過調(diào)控多種基因的表達，參與免疫反應、炎癥反應、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移等多種生物進程。大量研究表明，IL-1β誘導軟骨細胞炎癥介質(zhì)的表達是通過NF-κB來介導的，在靜息狀態(tài)下，IκBα 與 NF-κB的p65、p50兩個亞單位以失活狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中。當上游信號(通常是由MyD88介導的TLR4/NF-κB 信號通路)激活IκB 激酶后，活化的 IκB 激酶會泛素化、磷酸化并降解 IκBα，使得NF-κB 2個亞單位從失活狀態(tài)活化，并從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)(尤其是p65亞單位)，與相應的炎癥相關基因結(jié)合，啟動炎癥細胞因子轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)炎癥，包括iNOS和COX-2［23-25］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷可以抑制因IL-1β誘導而引起的IκBα的降解。據(jù)此，我們推測橄欖苦苷通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路而產(chǎn)生抗炎作用。由于橄欖苦苷對體外軟骨細胞作用的結(jié)果不能完全代表體內(nèi)，在動物模型中是否有同樣的效果仍需要進一步的驗證。

［1］ Kim KS，Oh da H，Choi HM，et al.Pyrrolidine dithiocarbamate， a NF-κB inhibitor， upregulates MMP-1 and MMP-13 in IL-1beta-stimulated rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes［J］.Eur J Pharmacol，2009，613(1-3):167-175.

［2］ Menendez JA，Vazquez-Martin A，Colomer R，et al.Olive oil’s bitter principle reverses acquired autoresistance to trastuzumab(Herceptin)in HER2-overexpressing breast cancer cells.［J］.BMC Cancer，2007，7:80.

［3］ Miles EA，Zoubouli P，Calder PC.Differential anti-inflammatory effects of phenolic compounds from extra virgin olive oil identified in human whole blood cultures［J］.Nutrition，2005，21(3):389-394.

［4］ Covas MI.Bioactive effects of olive oil phenolic compounds in humans:reduction of heart disease factors and oxidative damage［J］.Inflammopharmacology，2008，16(5):216-218.

［5］ Vissers MN，Zock PL，Katan MB.Bioavailability and antioxidant effects of olive oil phenols in humans:a review［J］.Eur J Clin Nutr，2004，58(6):955-965.

［6］ Salvini S，Sera F，Caruso D，et al.Daily consumption of a high-phenol extravirgin olive oil reduces oxidative DNA damage in postmenopausal women［J］.Br J Nutr，2006，95(4):742-751.

［7］ Daheshia M，Yao JQ.The interleukin 1beta pathway in the pathogenesis of osteoarthritis［J］.J Rheumatol，2008，35(12):2306-2312.

［8］ Martel-Pelletier J.Pathophysiology of osteoarthritis［J］.Osteoarthritis Cartilage，1998，6(2):374-375.

［9］ Shalom-Barak T，Quaeh J，Lotz M.Interleukin-17-induced gene expression in articular chondrocytes is associated with activation of mitogen-activated protein kinases and NF-κB［J］.J Biol Chem，1998，273(42):27467-27473.

［10］ Hashimoto S，Takahashi K，Oehs RL，et al.Nitric oxide produetion and apoptosis in cells of the meniscus during experimental osteoarthritis［J］.Arthritis Rheum，1999，42(5):2123-2131.

［11］ 李 鋒，聶喜增，馬湘毅.`骨性關節(jié)炎患者血清和關節(jié)液中自由基水平及意義［J］.河北醫(yī)藥，2007，29(l):36-37.

［12］ 童 敏，高 戈，高潔生，等.白黎蘆醇甲基化衍生物對兔骨關節(jié)炎模型關節(jié)液及血清NO和iNOS水平的影響［J］.湖南中醫(yī)藥大學學報，2007，27(5):44-46.

［13］ 劉世清，何炳書，彭 昊，等.四環(huán)素對骨關節(jié)炎模型關節(jié)液及血液中iNOS和NO水平的影響［J］.武漢大學學報:醫(yī)學版，2004，25(3):299-301.

［14］ Zhang X，Cao J，Zhong L.Hydroxytyrosol inhibits pro-inflammatory cytokines，iNOS，and COX-2 expression in human monocytic cells［J］.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2009，379(6):581-586.

［15］ Pelletier JP，DiBattista JA，Roughley P，et al.Cytokines and inflammation in cartilage degradation［J］.Rheum Dis Clin North Am，1993，19(3):545-568.

［16］ Meulenbelt I，Bijkerk C，Miedema HS，et al.A genetic association study of the IGF-1 gene and radiological osteoarthritis in a population-based cohort study(the Rotterdam Study)［J］.Ann Rheum Dis，1998，57(6):371-374.

［17］ Hart DJ，Spector TD.The classification and assessment of osteoarthritis［J］.Baillieres Clin Rheumatol，1995，9(2):407-432.

［18］ Iannone F，Lapadula G.The pathophysiology of osteoarthritis［J］.Aging Clin Exp Res，2003，15(5):364-372.

［19］ Fell HB，Jubb RW.The effect of synovial tissue on the breakdown of articular cartilage in organ culture［J］.Arthritis Rheum，1977，20(7):1359-1371.

［20］ Yudoh K，Shishido K，Murayama H，et al.Water-soluble C60 fullerene prevents degeneration of articular cartilage in osteoarthritis via down-regulation of chondrocyte catabolic activity and inhibition of cartilage degeneration during disease development［J］.Arthritis Rheum，2007，56(10):3307-3318.

［21］ Carlo MD，Schwartz D，Erickson EA，et al.Endogenous production of reactive oxygen species is required for stimulation of human articular chondrocyte matrix metalloproteinase production by fibronectin fragments［J］.Free Radical Biol Med，2007，42(9):1350-1358.

［22］ Tak PP，F(xiàn)irestein GS.NF-κB:a key role in inflammatory diseases［J］.J Clin Invest，2001，107(1):7-11.

［23］ Gilston V，Jones HW，Soo CC，et al.NF-κB activation in human knee-joint synovial tissue during the early stage of joint inflammation［J］.Biochem Soc Trans，1997，25(3):518S.

［24］ Miagkov AV，Kovalenko DV，Brown CE，et al.NF-κB activation provides the potential link between inflammation and hyperplasia in the arthritic joint［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95(23):13859-13864.

［25］ 邢飛躍，趙克森，姜 勇.NF-κB的信號通路與阻斷策略［J］.中國病理生理雜志，2003，19(6):849-855.