去甲斑蝥素對人肝癌SMMC－7721細胞凋亡相關因子半胱天冬酶3、bax和細胞色素C表達的影響

張 梅 黑龍江中醫(yī)藥大學生物化學與分子生物學教研室 （哈爾濱150040）

去甲斑蝥素的化學結構和天然藥物斑蝥素類似，僅在后者的1，2位去甲基，已能人工化學合成。經過化學結構的修改，可大大降低斑蝥素對泌尿系統(tǒng)的刺激性，國內外文獻通過體內外研究證實去甲斑蝥素對多種人惡性腫瘤細胞具有一定的抑制作用，而其抗腫瘤活性的機制是誘導腫瘤細胞凋亡［1－3］。去甲斑蝥素目前已用于臨床治療胃癌、肝癌和食管癌等，除了能有效抑制腫瘤細胞生長之外，還有升白細胞的臨床作用［4－5］。本研究主要討論去甲斑蝥素對人肝癌SMMC－7721細胞增殖的影響，并嘗試通過分子生物學手段探討其誘導腫瘤細胞凋亡的作用機制。

1 試劑和儀器 1.1 藥物和試劑 去甲斑蝥素（山東信誼制藥有限公司，批號20130527）；RPMI－1640培養(yǎng)基（美國Gibico公司）；小牛血清（武漢華美生物工程公司）；胰蛋白酶（美國 Gibco公司）；3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽（MTT）（上海普飛生物技術有限公司）；細胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板（美國Costar公司）。Annexin V－FITC／PI凋亡檢測試劑盒（美國Beckman Coulter公司）；線粒體－胞漿分離試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）；活化半胱天冬酶3（caspase－3）、bax、細胞色素C抗體（美國Bioworld公司）。

1.2 儀 器 LDZ5－2型離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國Forma公司）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；Epics－XL－Ⅱ型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）；ELx808型吸收光酶標儀（美國伯騰儀器公司）。

1.3 細 胞 人肝癌SMMC－7721細胞株（中國科學院上海生科院細胞資源中心）。將SMMC－7721細胞株置含有10%小牛血清和80U／L慶大霉素的RPMI－1640細胞培養(yǎng)基（pH＝7.4）內，在37℃恒溫、5%CO2環(huán)境下孵育。

2 方 法 2.1 腫瘤細胞生長抑制率 將對數(shù)生長期的SMMC－7721細胞株用培養(yǎng)基稀釋至細胞濃度為105個／mL，將100μL細胞液分別接種在96孔細胞培養(yǎng)板的每個孔內，在37℃恒溫和5%CO2環(huán)境下孵育24h后再加入等體積去甲斑蝥素的培養(yǎng)基溶液，去甲斑蝥素的終濃度為1、5、25、125mg／L，以上各個濃度梯度作為藥物組，另用不加藥物的細胞孔作為對照組，用培養(yǎng)基作為空白組，藥物組、對照組、空白組均設置平行孔以減少實驗誤差。在24h、48h和72h后避光操作加入5mg／mL濃度的MTT溶液20μL，繼續(xù)37℃恒溫避光培養(yǎng)細胞3h后結束培養(yǎng)。在每個孔中加入0.15mL二甲亞砜，處理5min后將培養(yǎng)板置酶標儀中，在波長570nm處測定吸光值，通過空白組的平均吸光值校正藥物組和對照組的吸光值，則：腫瘤細胞生長抑制率（%）＝（1－藥物組吸光值／對照組吸光值）×100%。

2.2 腫瘤細胞凋亡率 收集培養(yǎng)24h后的SMMC－7721細胞，用無水乙醇固定，置－70℃冰箱中保存。用磷酸鹽緩沖液沖洗固定后的細胞，1200r／min離心5min，分別加入熒光染色劑Annexin V－FITC使成終濃度20μg／mL，避光染色20min，再加入5μL PI染色劑使成終濃度50μg／mL，在37℃下避光染色40min，采用流式細胞儀檢測細胞周期的變化。

2.3 caspase－3、bax和細胞色素C的表達 對照組和藥物組細胞培養(yǎng)24h后，采用磷酸鹽緩沖液沖洗分散和沖洗3遍，在3000r／min下離心10min，將沉淀懸浮在200μL預冷的細胞裂解液中，冰浴1h后在12000r／min下離心20min，棄去沉淀得到細胞的總蛋白，而檢測細胞色素C表達水平采用胞漿蛋白。將緩沖液加入上述蛋白，在沸水中水浴10min，采用聚丙烯酰胺（SDS－PAGE）凝膠電泳法分離不同類型的蛋白，再轉移至聚偏二氟乙烯膜后，在37℃恒溫下處理50min，采用免疫印跡法按步驟獲得熒光二抗后測定caspase－3、bax和細胞色素C的表達水平。

2.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，計量資料的比較采用t檢驗，檢驗水準α＝0.05。

3 結 果 3.1 腫瘤細胞生長抑制率 不同濃度的去甲斑蝥素對SMMC－7721細胞有不同的抑制率，表現(xiàn)出對腫瘤細胞的細胞毒作用（n＝6）。相同濃度的去甲斑蝥素作用時間越長，細胞生長抑制率越高；作用相同時間的去甲斑蝥素濃度越高，細胞生長抑制率越高。去甲斑蝥素對SMMC－7721細胞生長抑制率見表1。

表1 去甲斑蝥素對SMMC－7721細胞生長的抑制率（±s）

表1 去甲斑蝥素對SMMC－7721細胞生長的抑制率（±s）

去甲斑蝥素濃度（mg／L）細胞生長抑制率（%）作用24h后 作用48h后 作用72h后1 6.24±1.49 9.48±2.65 23.46±6.97 5 20.45±3.86 24.07±4.16 38.65±6.43 25 36.57±8.40 46.71±8.52 59.56±7.25 125 59.30±12.12 58.45±9.85 81.24±13.12

3.2 腫瘤細胞凋亡率 經過不同濃度去甲斑蝥素處理的SMMC－7721細胞恒溫培養(yǎng)24h后，通過流式細胞儀測定細胞的凋亡情況（n＝6），結果見表2。藥物組細胞均有不同程度的早期凋亡和晚期凋亡。隨著去甲斑蝥素濃度的提高，總凋亡率相應升高；藥物組的總凋亡率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（t＝10.758、16.931、33.955、22.358，P 均＜0.05）。

表2 去甲斑蝥素對SMMC－7721細胞的凋亡率（±s）

表2 去甲斑蝥素對SMMC－7721細胞的凋亡率（±s）

注：與對照組比較，△P＜0.05

去甲斑蝥素濃度（mg／L）早期凋亡率（%） 晚期凋亡率（%）總凋亡率（%）對照組0.12±0.08 0.31±0.12 0.43±0.11 1 4.54±2.49 9.46±3.28 14.01±3.09△5 11.74±4.58 23.95±3.09 35.69±5.10△25 20.07±6.15 48.38±9.11 68.46±8.24△125 27.67±8.19 61.03±10.80 88.70±9.67△

表3 去甲斑蝥素對caspase－3、bax和細胞色素C表達的影響（±s）

表3 去甲斑蝥素對caspase－3、bax和細胞色素C表達的影響（±s）

注：與對照組比較，△P＜0.05

去甲斑蝥素濃度（mg／L）積分吸光度caspase－3 bax 細胞色素C對照組0.21±0.08 0.16±0.05 0.18±0.06 1 0.19±0.07 0.13±0.04 0.25±0.05 5 0.23±0.11 0.15±0.06 0.18±0.07 25 0.46±0.12△ 0.22±0.03△ 0.50±0.12△125 0.77±0.19△ 0.46±0.09△ 0.48±0.14△

3.3 caspase－3、bax和細胞色素C的表達 經過不同濃度去甲斑蝥素處理的SMMC－7721細胞恒溫培養(yǎng)24h后，通過免疫印跡法測定caspase－3、bax和細胞色素C的積分吸光度（n＝6），結果見表3。可見，隨著去甲斑蝥素的濃度提高，caspase－3、bax和細胞色素C的表達量均升高；濃度為25、125mg／L的去甲斑蝥素處理細胞后，caspase－3、bax和細胞色素C的蛋白表達量均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（t＝4.246、2.521、5.842、6.654、7.137、4.825，P 均＜0.05）。

4 討 論 斑蝥素是昆蟲斑蝥的主要抗腫瘤有效成分，可治療食管癌、肝癌、胃癌和乳腺癌等多種惡性腫瘤疾病，然而斑蝥素口服后會產生較嚴重的胃腸道不良反應，限制其臨床進一步推廣應用［6］。去甲斑蝥素去除斑蝥素分子中的1，2位兩個甲基，并實現(xiàn)人工合成，價格較低廉，可大大降低消化道不良反應的發(fā)生率，且具有與斑蝥素相同的抗腫瘤活性，還有升高白細胞的作用，骨髓抑制現(xiàn)象較少見［7－8］。近年來有關去甲斑蝥素的藥理作用研究逐步深入開展，并可制備成多種藥物新劑型［9－11］，大大拓展了其臨床應用前景，但在分子生物學水平對去甲斑蝥素的研究尚需進一步探討和明確。

采用MTT染色可檢測藥物對腫瘤細胞生長的抑制情況。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的去甲斑蝥素均有對腫瘤細胞的細胞毒作用。濃度為25mg／L的去甲斑蝥素作用48h時間后，以及濃度為125mg／L的去甲斑蝥素作用24h時間后，細胞生長抑制率均超過50.00%。因此，去甲斑蝥素對SMMC－7721細胞的抑制作用具有明顯的劑量－時間相關性，越高的藥物濃度和越長的作用時間可產生更大的抑制率。通過流式細胞儀測定細胞的凋亡情況，可見去甲斑蝥素可促進SMMC－7721細胞的早期凋亡和晚期凋亡，且凋亡率與劑量有相關性，隨著去甲斑蝥素濃度的提高，總凋亡率相應升高。這表明去甲斑蝥素是通過誘導腫瘤細胞凋亡抑制SMMC－7721細胞的生長。

半胱天冬酶家族為介導和執(zhí)行腫瘤細胞凋亡的相關因子，caspase－3可破壞腫瘤細胞內的調節(jié)蛋白與結構蛋白，而bax和細胞色素C也均與細胞凋亡過程有關［12］。腫瘤細胞的細胞色素C在線粒體表達而轉運至細胞質內，激活caspase－3酶原使之成為活性caspase－3發(fā)揮細胞凋亡的作用［13］。bax是細胞凋亡的重要調節(jié)因子，參與線粒體外膜的蛋白轉運通道的形成，促進細胞色素C的轉運，并可降低機體內原癌基因對腫瘤細胞增殖的抑制作用［14－15］。本研究結果表明，去甲斑蝥素可提高caspase－3、bax和細胞色素C的表達量，且以上三種凋亡因子的表達量與去甲斑蝥素的劑量有相關性，濃度為25、125mg／L的去甲斑蝥素處理細胞后，caspase－3、bax和細胞色素C的蛋白表達量顯著提高。因此，去甲斑蝥素誘導SMMC－7721細胞凋亡的作用機制在于上調bax的表達量，促進線粒體中的細胞色素C釋放入細胞質內激活caspase－3酶原為活性caspase－3，最終活性caspase－3直接執(zhí)行了腫瘤細胞的早期凋亡和晚期凋亡過程。

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