碰碰香高效離體再生體系的建立

張娜

（山西省林業(yè)科學研究院，山西 太原030012）

碰碰香（Plectranthustomentosa），又名延命草、絨毛香茶菜，屬唇形科香茶菜屬多年生灌木狀草本植物［1］。因觸碰后可散發(fā)出令人舒適的香氣而享有“碰碰香”的美稱；又因其香味濃甜，頗似蘋果香味，故又享有“蘋果香”美譽。作為盆栽觀賞，可放置高處或懸吊在室內，備受市場青睞。其葉片可泡茶、酒，奇香誘人，具有提神醒腦、清熱解暑、驅避蚊蟲功效［2］。

碰碰香一般采用播種或扦插繁殖方法進行繁殖，但播種方法周期長，且容易發(fā)生變異，其優(yōu)良性狀不易保持。目前有關于碰碰香水培扦插繁殖方面的研究報道［3］，但扦插繁殖容易引起病毒的積累，導致觀賞品質降低。因此，尋求一種高效、快速的繁殖方法是碰碰香生產中亟需解決的技術難題。組織培養(yǎng)因其培養(yǎng)周期短、繁殖速度快、苗木規(guī)格一致，是快速、大規(guī)模繁殖碰碰香的必然選擇。

目前尚未發(fā)現碰碰香組織培養(yǎng)方面的研究報道。本研究以碰碰香幼嫩莖段作為外植體，對碰碰香腋芽誘導、增殖培養(yǎng)及生根培養(yǎng)的影響因素進行研究，旨在建立高效、完善的碰碰香離體培養(yǎng)再生體系，為大規(guī)模、快速繁殖碰碰香優(yōu)良品種提供技術支持，也為其它觀賞植物的組培快繁提供技術借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇植株生長健壯的碰碰香幼嫩莖段作為外植體材料。

將莖段洗凈后，在超凈工作臺上，先用75%的酒精滅菌10～30s，無菌水沖洗3次，再用0.1%氯化汞（HgCl2）進行不同時間的滅菌處理后，無菌水沖洗5～6次，并切成1.5cm左右的莖段，每個莖段至少帶一個腋芽，準備接種。

1.2 試驗方法

1.2.1 滅菌時間對碰碰香莖段消毒的影響

本試驗采用0.1%HgCl2作為滅菌劑，滅菌時間梯度分別為3、4、5和6min。外植體經滅菌處理后接種培養(yǎng)于MS培養(yǎng)基中，每處理均為30瓶，每瓶接種1個外植體，重復3次，4周后對污染率、死亡率和成活率進行觀察統計。

1.2.2 基本培養(yǎng)基對碰碰香莖段腋芽誘導的影響

采用MS、B5和WPM3種培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，每處理均為30瓶，重復3次，接種培養(yǎng)4周后，觀察碰碰香腋芽生長情況，統計誘導率，篩選碰碰香腋芽誘導的最佳基本培養(yǎng)基。

1.2.3 BA濃度對碰碰香試管苗增殖的影響

采用上述篩選的最佳基本培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，添加0.2mg·L－1NAA，再添加不同濃度的BA，具體濃度為0.5、1.0、2.0、3.0mg·L－1，每處理均為30瓶，重復3次，培養(yǎng)4周后，觀察試管苗增殖情況，統計增殖率和增殖系數。

1.2.4 生長素對碰碰香試管苗生根的影響

將繼代增殖的試管苗轉接于1／2MS基本培養(yǎng)基，并分別添加不同濃度（0.5，1.0，2.0mg·L－1）的NAA和IBA，未添加生長素的培養(yǎng)基作為對照，每處理均為30瓶，重復3次，4周后統計生根率，篩選碰碰香的最佳生根培養(yǎng)基。

1.2.5 煉苗移栽

選取90株生長健壯的生根苗進行煉苗移栽。首先將其放置生長室進行煉苗，兩周后從錐形瓶中取出生根苗，洗凈根部的培養(yǎng)基，然后移栽到含有土壤、沙子和泥炭的混合基質（1∶1∶1）中，在溫室條件下生長。30d后統計移栽成活率。

1.3 培養(yǎng)條件

所有培養(yǎng)基中均添加蔗糖3%，瓊脂0.45%，pH調至5.8～5.9，121℃高壓滅菌15min。所有培養(yǎng)物均培養(yǎng)于25±2℃培養(yǎng)室，光照強度為2500lx～3000lx，光照時間為14～16h·d－1。

1.4 數據統計

將所有數據采用SPSS統計軟件進行方差分析，并采用Duncan多重比較方法進行顯著性檢驗。具體指標計算如下：

污染率 ＝ 污染的外植體數／接種的外植體總數×100%

死亡率 ＝ 死亡的外植體數／接種的外植總體數×100%

成活率＝1－污染率－死亡率

腋芽誘導率 ＝ ［誘導出腋芽的外植體總數／（接種的外植體總數－污染的外植體數）］×100%

增殖率 ＝ 出現增殖芽數／總接種芽數×100%

增殖系數 ＝ 增殖后總芽數／發(fā)生增殖的芽數

生根率 ＝ 生根的芽數／接種總數×100%

2 結果與分析

2.1 滅菌時間對碰碰香莖段外植體滅菌效果的影響

方差分析表明，滅菌時間對外植體污染率、死亡率和成活率均有極顯著影響（P＜0.001）。

表1 滅菌時間對莖段外植體滅菌效果的影響Table 1 Effect of treatment time on disinfection of stem segment explants

當滅菌時間為3min時，污染率較高，成活率僅為65.4%；隨著滅菌時間的延長，污染率逐漸降低；當滅菌時間為4min時，污染率和死亡率均較低，成活率最高，達86.9%；當滅菌時間延長為5 min時，污染率較低，為8.5%，但死亡率較高，達22.3%，成活率僅為69.2%；繼續(xù)延長至6min時，污染率最低，為5.5%，但死亡率最高，達42.6%，成活率相對較低，僅51.8%，主要是由于滅菌時間過長所致（表1）。由此可見，4min是碰碰香莖段外植體的最佳滅菌時間。

2.2 基本培養(yǎng)基對碰碰香莖段腋芽誘導的影響

方差分析表明，不同基本培養(yǎng)基對碰碰香莖段腋芽誘導效果影響顯著（P＝0.022）。3種基本培養(yǎng)基中，MS基本培養(yǎng)基的腋芽誘導率最高，達95.9%，腋芽萌發(fā)時間較早，在5～6d即開始萌發(fā)，葉片伸展較快，植株長勢良好。B5和WPM培養(yǎng)基中腋芽誘導率略低，分別為90.4%和86.1%，腋芽萌發(fā)時間較晚，均在7～8d開始萌發(fā)，而且植株長勢細弱，葉片伸展較慢（表2）。由此可見，MS培養(yǎng)基是碰碰香莖段腋芽誘導的最適基本培養(yǎng)基。

表2 基本培養(yǎng)基對腋芽誘導的影響Table 2 Effect of basal medium on induction of axillary bud

2.3 BA濃度對碰碰香試管苗增殖的影響

方差分析表明，不同BA濃度對碰碰香試管苗增殖率和增殖系數差異顯著（分別為P＝0.004和P＝0.041）。當BA濃度為0.5mg·L－1時，試管苗增殖率為85.3%，增殖系數達6.4；當BA濃度提高到1.0mg·L－1時，試管苗增殖率和增殖系數均達到最高，分別為96.3%和12.9。隨著BA濃度的升高，增殖率和增殖系數呈下降趨勢。BA濃度提高至 2.0mg·L－1時，試管苗增殖率達90.9%，增殖系數為9.7，而且試管苗出現輕微玻璃化現象；當BA濃度繼續(xù)提高至3.0mg·L－1時，增殖率和增殖系數均較低，分別為83.7%和7.3，而且試管苗玻璃化現象加?。ū?）。由此可見，培 養(yǎng) 基 中 添 加 1.0mg·L－1BA 和 0.2 mg·L－1NAA為碰碰香試管苗的最佳增殖培養(yǎng)基。

表3 BA濃度對試管苗增殖的影響Table 3 Effect of different concentrations of BA on shoot proliferation

2.4 生長素對碰碰香試管苗生根的影響

試驗發(fā)現，當培養(yǎng)基中未添加生長素或單獨添加NAA或IBA時，試管苗均能生根，不同培養(yǎng)基間的生根率存在顯著差異（P＝0.002）。

當培養(yǎng)基中未添加任何生長素時，生根率達90.3%，根系細弱，試管苗長勢較弱。當培養(yǎng)基中添加NAA時，生根率顯著提高，根系粗壯，試管苗長勢良好。當添加0.5mg·L－1NAA時，生根率達95.0%；NAA濃度提高到1.0mg·L－1時，生根率最高，達99.3%；繼續(xù)提高NAA濃度至2.0 mg·L－1時，生根率略有降低（表4）。

當培養(yǎng)基中添加IBA時，生根率與對照相比也顯著提高，但根系細弱，試管苗長勢較弱。當IBA濃度為1.0mg·L－1時，生根率最高，達96.1%；IBA濃度高于或低于1.0mg·L－1時，生根率均略有降低（表4）。由此可見，培養(yǎng)基中添加1.0mg·L－1NAA是碰碰香試管苗的最佳生根培養(yǎng)基。

2.5 煉苗移栽

生根苗經煉苗后移栽至溫室，生長30d后，移栽成活率高達94.2%，且生長表現正常。

3 結論與討論

有效控制外植體污染是植物組織培養(yǎng)成功的先決條件［4］。適宜的滅菌時間既能達到良好的滅菌效果，又對外植體的損傷較小。本研究采用0.1%HgCl2作為滅菌劑，設置了4個梯度對滅菌時間進行篩選，研究結果表明，4min是碰碰香莖段外植體的最佳滅菌時間。高建莉等［5］對長壽花幼莖外植體進行滅菌試驗發(fā)現，采用0.1%HgCl2消毒10min是長壽花幼莖外植體的最佳滅菌時間。王大平［6］對常綠歐洲莢蒾莖段進行滅菌試驗發(fā)現，0.1%HgCl2消毒8min是常綠歐洲莢蒾莖段的最佳滅菌時間。由此可見，不同植物莖段外植體的最佳滅菌時間不盡相同。

表4 生長素對試管苗生根的影響Table 4 Effect of different auxins on rooting of in vitro regenerated shoots

基本培養(yǎng)基的選擇直接影響莖段外植體的腋芽誘導效果。本研究結果表明，在MS基本培養(yǎng)基中，腋芽誘導率最高，達95.9%，腋芽萌發(fā)時間較早，葉片伸展較快，植株長勢良好。B5和WPM培養(yǎng)基的腋芽誘導率略低，腋芽萌發(fā)時間較晚，而且植株長勢細弱，葉片伸展較慢?？赡苁怯捎贛S基本培養(yǎng)基中的無機鹽含量高，尤其是硝酸鹽、銨離子和鉀離子含量豐富，更適宜碰碰香腋芽誘導及生長［4］。何克勤等也采用MS基本培養(yǎng)基對甜葉菊莖段外植體進行腋芽誘導［7］。

基本培養(yǎng)基需要配合使用適當的植物生長調節(jié)劑才能誘導細胞分裂的啟動、培養(yǎng)物形態(tài)建成、芽和根的分化與發(fā)育等［8］。本試驗采用不同濃度BA與0.2mg·L－1NAA組合對碰碰香試管苗進行增殖試驗研究，發(fā)現BA濃度為1.0mg·L－1時，試管苗增殖率和增殖系數最高，是碰碰香試管苗的最佳增殖培養(yǎng)基。高建莉等［5］研究發(fā)現，長壽花莖段的最佳增殖培養(yǎng)基為 MS添加1.0mg·L－1BA與0.1mg·L－1NAA。

培養(yǎng)基中添加適當濃度的生長素有利于根的形成和生長。一般常用的生長素包括NAA和IBA［4］。本研究結果表明，IBA對碰碰香試管苗的生根效果不及NAA生根效果好。培養(yǎng)基添加1.0mg·L－1NAA 的生根率最高，達99.3%，根系粗壯，試管苗長勢良好；而在添加IBA的培養(yǎng)基中，生根率也較高，但根系細長，試管苗長勢較弱。Alam I等［9］對蓖麻試管苗的生根研究表明，NAA的生根效果更佳。筆者在進行文冠果試管苗生根研究時發(fā)現，IBA更適宜文冠果試管苗生根誘導?？梢?，不同植物種類需要不同的生長素用于誘導生根。

［1］孔維維，呂鼎豪，李華，等.碰碰香不同部位揮發(fā)性成分的分析［J］.藥物分析雜志，2013，33（2）：241－245.

［2］熊偉，金荷仙，蔡寶珍.碰碰香揮發(fā)物化學成分分析［J］.浙江農林大學學報，2011，28（4）：680－684.

［3］馬振翠，姚洪慶，郭明明，等.碰碰香水培扦插繁殖技術研究［J］.黑龍江農業(yè)科學，2014（11）：96－98.

［4］王蒂 .植物組織培養(yǎng)［M］.北京：中國農業(yè)出版社，2004：29.

［5］高建莉，王定開.長壽花組織培養(yǎng)技術研究［J］.云南農業(yè)科技，2009，（5）：11－13.

［6］王大平.常綠歐洲莢蒾離體繁殖的啟動和增殖培養(yǎng)研究［J］.江蘇農業(yè)科學，2011，39（5）：67－68.

［7］何克勤，胡能兵，崔廣榮，等.甜葉菊莖段腋芽誘導培養(yǎng)基和NaN3誘變條件篩選及誘變試管苗POD同工酶分析［J］.植物資源與環(huán)境學報，2012，21（3）：74－79.

［8］譚文澄，戴策剛 .觀賞植物組織培養(yǎng)［M］.北京：中國林業(yè)出版社，1991：117.

［9］Alam I，Sharmin S A，Mondal S C，et al.In vitromicropropagation through cotyledonary node culture of castor bean （Ricinuscommunis L.）［J］.Aust J Crop Sci，2010，4：81－84.