高粱MATE基因的克隆及在酵母中的重金屬耐受性分析

張?zhí)O，張源，王慧春，王文穎﹡，徐進﹡

（1.青海師范大學生命與地理科學學院，青海 西寧810008；2.中國科學院西雙版納熱帶植物園，云南 昆明650223；3.荒漠與綠洲生態(tài)國家重點實驗室，中國科學院新疆生態(tài)與地理研究所，新疆 烏魯木齊830011）

MATE轉(zhuǎn)運蛋白 （multidrug and toxic compound extrusion transporter）是一類多藥耐藥性家族轉(zhuǎn)運蛋白，它們的活性依賴于跨膜電化學勢提供的能量［1］。在擬南芥中至少有56個基因?qū)儆贛ATE基因，在水稻基因組中也至少發(fā)現(xiàn)了50個MATE基因［2］。MATE家族在植物中的序列多樣性以及表達模式的差異，決定了它們的功能差異性。最初發(fā)現(xiàn)，MATE家族的基因在細胞解毒機制中起重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)，該家族基因在植物響應(yīng)重金屬毒害過程中也可能發(fā)揮重要作用［3］。

當今世界，重金屬污染對農(nóng)業(yè)和人類生活帶來的影響日趨嚴重。一些重金屬元素如Cu、Fe、Mn、Mo、Ni和Zn是植物的必需元素，缺乏這些元素會導致作物減產(chǎn)［4，5］，然而，濃度過高時則對植物造成傷害。Zn主要來源于采礦、電鍍和冶煉行業(yè)污染物的排放。土壤中Zn超過200mg·kg－1時則可能對植物生長造成危害，過量Zn可以直接導致植物發(fā)生Zn中毒［6］。研究植物對Zn吸收、運輸和累積的生理與分子機理，鑒定植物中的Zn轉(zhuǎn)運蛋白，對于我們利用生物技術(shù)手段培育Zn高效利用作用，以及植物修復技術(shù)均有重要的意義。高粱是一種重要的能源經(jīng)濟作物，具有較高的重金屬耐受性。為分離鑒定高粱中Zn響應(yīng)的基因，我們通過深度測序技術(shù)，分析了高粱根系中差異表達的基因，發(fā)現(xiàn)了一個顯著受Zn缺乏誘導的MATE家族基因SbMATE。我們利用酵母功能互補試驗對該基因的功能進行了初步分析，為進一步探明該基因在植物Zn吸收和Zn毒害耐受中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

植物材料高粱品種BTx623由中科院景海春研究員饋贈。酵母菌株YK44（ura3－52his3－200，ΔZRC，ΔCot1，mating typeα）為 Zn／Cd／Ni／Co敏感型，受贈于德國Dietrich H.Nies教授。穿梭表達載體pYES2帶有GAL1啟動子，用于在酵母中高效表達SbMATE。

1.2 方法

1.2.1 SbMATE基因的克隆、測序及同源性分析

通過高通量的差異基因表達分析測序技術(shù)（DGE技術(shù)），我們鑒定了高粱根系中Zn缺乏下差異表達的基因，發(fā)現(xiàn)了一個MATE家族基因Sb04g031980顯著受Zn缺乏的誘導，故命名為SbMATE。在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進行同源核苷酸檢索，并進行蛋白質(zhì)同源性比較，通過Treeview進行系統(tǒng)進化樹分析。測序和引物合成由上海生工和北京中美泰和公司完成。

1.2.2 酵母菌株、質(zhì)粒及酵母表達載體的構(gòu)建

以HindIII／BamHI為酶切位點設(shè)計引物，分別 構(gòu) 建 pYES2－SbMATE 和 pYES2－SbMATEGFP穿梭表達載體。并構(gòu)建pYES2－GFP穿梭表達載體作為基因在酵母中亞細胞定位的對照。

采用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化酵母菌株YK44，通過尿嘧啶營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基篩選陽性克隆，并通過菌落PCR進行鑒定。

在YPD培養(yǎng)基 （1%酵母浸提液、2%蛋白胨、2%葡萄糖，pH5.8）中添加響應(yīng)濃度的重金屬，進行脅迫處理試驗。

1.2.3 酵母細胞中SbMATE亞細胞定位

將 轉(zhuǎn) 化 pYES2－SbMATE－GFP 和 pYES2－GFP穿梭表達載體的酵母YK44陽性菌株，在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP熒光，分析SbMATE在酵母細胞中的亞細胞定位情況。

1.2.4 酵母重金屬耐受試驗

YK44－pYES2、YK44－pYES2－ SbMATE 在SD－ura培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長1d，OD600達到0.2，取100uL培養(yǎng)物接種到10mL SD－ura（2%半乳 糖）＋ CdCl2（0.01～0.05mmol·L－1）或ZnCl2（0.04～0.20mmol·L－1）或者CoCl2（0.1～0.5mmol·L－1）的含有不同濃度的重金屬的培養(yǎng)基中，30℃，250r·min－1，培養(yǎng)36h后測定600 nm吸光值，試驗取3個酵母陽性克隆，每個克隆做3個重復，取平均值并計算標準誤差。

2 結(jié)果和分析

2.1 高粱SbMATE基因的克隆與相似性分析

為了分離和鑒定高粱中Zn響應(yīng)的基因，通過深度測序技術(shù)，我們分析了高粱根系中差異表達的基因，發(fā)現(xiàn)了一個受Zn缺乏顯著誘導的MATE家族轉(zhuǎn)運蛋白基因Sb04g031980。序列分析表明，該片段長1 704bp，經(jīng)DNAman軟件分析，證明該序列編碼了一個完整的讀碼框（圖1），含有一個1 704bp的ORF，編碼一個由567個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量53.9kD。其蛋白含有兩個MATE結(jié)構(gòu)域，分別位于88～248bp和310～472bp處。我們將該基因命名為SbMATE。

MATE在生物體的生命活動中起著重要的作用，其結(jié)構(gòu)和功能非常保守。將SbMATE（Sb04g031980）編碼區(qū)序列經(jīng)GenBankBlast比對后，發(fā)現(xiàn)與大多數(shù)高等植物MATE，如玉米、粟等同源性都很高，大于90%。其編碼蛋白質(zhì)一級序列更顯示了其蛋白質(zhì)的保守性，ClustalW分析（圖2）顯示該蛋白質(zhì)與玉米GRMZM2G135175和小米Si016794m編碼的蛋白質(zhì)在其兩個MATE結(jié)構(gòu)域內(nèi)同源性高于98%。在高粱的MATE家族中進化關(guān)系如圖3所示，SbMATE（Sb04g031980）與另一個 MATE家族轉(zhuǎn)運蛋白Sb06g025870位于同一個分支上。

圖1 高粱SbMATE（Sb04g031980）基因及編碼蛋白Fig.1 Gene and protein sequences of SbMATE（Sb04g031980）

圖2 高粱MATE基因編碼的氨基酸序列與其他植物MATE基因編碼氨基酸序列比較Fig.2 Comparative analysis of protein sequence of SbMATE and their plant MATEs

圖3 高粱MATE蛋白質(zhì)序列系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Sorghum MATE protein

2.2 pYES2－SbMATE 和 pYES2－SbMATE－GFP表達載體的構(gòu)建、酵母轉(zhuǎn)化及陽性克隆的篩選

為了進一步研究SbMATE在酵母細胞中的亞細胞定位，以及在重金屬脅迫下的作用，將Sb－MATE經(jīng)HindIII／BamHI雙酶切后，插入pYES2的PGAL1之后，構(gòu)建酵母表達載體pYES2－SbMATEGFP和pYES2－SbMATE，轉(zhuǎn)化酵母。載體信息如圖4，通過PCR分析鑒定陽性克隆，確認載體構(gòu)建成功。

圖4 pYES2－SbMATE、pYES2－SbMATE－GFP 和pYES2－GFP 表達載體圖譜Fig.4 Vector profile of pYES2－SbMATE，pYES2－SbMATE－GFPand pYES2－GFP

2.3 SbMATE在酵母細胞中的亞細胞定位分析

利用 YK44－pYES2－SbMATE－GFP轉(zhuǎn)基因酵母細胞，我們對SbMATE在酵母中的亞細胞定位進行了觀察。如圖5所示，SbMATE蛋白定位在酵母細胞的液泡中。

圖5 SbMATE在酵母細胞中的亞細胞定位觀察Fig.5 Subcellular localization of SbMATE in yeast cell

2.4 轉(zhuǎn)SbMATE基因酵母重金屬耐性分析

以轉(zhuǎn)空載體pYES2的酵母為對照，分別用不同濃度的Zn、Co、Ni、Cd脅迫處理SbMATE轉(zhuǎn)基因酵母菌株。如圖6，結(jié)果表明，半乳糖誘導下，所有測試濃度的Ni、Co和Cd處理下的SbMATE轉(zhuǎn)基因酵母生長狀況均與對照差異不顯著。但在0.05～0.10mmol·L－1ZnCl2處理下，SbMATE轉(zhuǎn)基因酵母細胞的生長狀況明顯優(yōu)于對照酵母細胞。這表明，SbMATE的過表達增強了酵母細胞對Zn毒害的耐受性。

圖6 SbMATE在酵母細胞中的重金屬耐性分析Fig.6 Heavy metal tolerance analysis of SbMATEin yeast cells

3 結(jié)論與討論

最初發(fā)現(xiàn)，MATE家族基因在細胞解毒機制中起重要作用。例如，最早鑒定出的擬南芥MATE家族基因ALF5（At3g23560）是一個四甲銨轉(zhuǎn)運蛋白［1］；而TT12（At3g59030）則編碼一個類黃酮轉(zhuǎn)運蛋白，該基因特異性地表達在胚珠和發(fā)育中的種子，將類黃酮轉(zhuǎn)運至種子內(nèi)表皮的液泡中［2］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，MATE家族中的一些蛋白在重金屬離子的吸收、運輸和累積中發(fā)揮重要作用。如FRD3（At3g08040）在根中特異性表達，該基因在根的木質(zhì)部裝載Fe螯合物，從而將Fe運輸至地上部葉片中［3］。水稻MATE蛋白屬于檸檬酸轉(zhuǎn)運蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，OsFRDL4受到Al的顯著誘導，參與了植物對Al毒害的耐受性。在高粱中還發(fā)現(xiàn)一個MATE轉(zhuǎn)運蛋白AltSB，在高粱對Al毒害的耐受性中也發(fā)揮著重要作用［7～10］。本研究從高粱Zn缺乏響應(yīng)的差異表達的基因中獲得了一個MATE家族基因SbMATE，通過GFP亞細胞定位研究發(fā)現(xiàn)，該基因定位在酵母細胞的液泡中。通過酵母重金屬耐性分析研究發(fā)現(xiàn)，該基因增加了YK44酵母細胞對Zn毒害的耐受性，表明該基因在重金屬耐受和累積過程中可能發(fā)揮重要作用。我們推測，定位于酵母液泡的SbMATE蛋白，可能通過將Zn吸收進酵母液泡中，從而降低了過量的Zn對細胞的毒害，因而提高了酵母細胞的耐受性。在今后的研究中，我們將進一步檢測酵母細胞中的Zn含量，并在植物中通過構(gòu)建過表達和抑制表達的轉(zhuǎn)基因植株，驗證該基因在植物Zn毒害和Zn缺乏響應(yīng)中的功能。

［1］Diener AC，Gaxiola RA，F(xiàn)ink GR.Arabidopsis ALF5，a multidrug efflux transporter gene family member，confers resistance to toxins［J］.Plant Cell，2001，13（7）：1625－1638.

［2］Debeaujon I，Peeters AJ，Leon－Kloosterziel KM，et al.The Transparent Testa 12 gene of Arabidopsis encodes a multidrug secondary transporter－like protein required for flavonoid sequestration in vacuoles of the seed coat endothelium ［J］.Plant Cell，2001，13（4）：853－871.

［3］喻絲絲，魏林艷，謝華安，等.MATE轉(zhuǎn)運蛋白在水稻抗逆作用中的研究進展［J］.福建農(nóng)業(yè)學報，2014，29（4）：398－405.

［4］張玉秀，徐進，王校，等.植物抗旱和耐重金屬基因工程研究進展［J］.應(yīng)用生態(tài)學報，2007，18（7）：1631－1639.

［5］王志香，周光益，吳仲民，等.植物重金屬毒害及其抗性機理研究進展［J］.河南林業(yè)科技，2007，27（2）：1003－2630.

［6］項長興，董雅文，錢君龍，等.南京棲霞山鉛鋅礦區(qū)土壤環(huán)境質(zhì)量評價［J］.土壤，1993，25（6）：319－322.

［7］Magalhaes JV，Liu J，Guimar?es CT，et al.A gene in the multidrug and toxic compound extrusion（MATE）family confers aluminum tolerance in sorghum ［J］.Nat Genet，2007，39（9）：1156－1161.

［8］Xu J，Sun JH，Du LG，et al.Comparative transcriptome analysis of cadmium responses in Solanum nigrumand Solanum torvum ［J］.New Phytol，2012a，196：110－124.

［9］Xu J，Zhu YY，Ge Q，et al.Comparative physiological responses of Solanum nigrumand Solanum torvumto cadmium stress［J］.New Phytol，2012b，196：125－138.

［10］Shi DQ，Zhang Y，Ma JH，et al.Identification of Zinc Deficiency－Responsive MicroRNAs in Brassica juncea Roots by Small RNA Sequencing［J］.J Integrative Agriculture，2013，12（11）：2036－2044.