響應(yīng)面法優(yōu)化籽瓜皮中高純度果膠的提取工藝

楊繼濤，楊 敏

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)資源化學(xué)與應(yīng)用研究所，甘肅 蘭州 730070）

籽瓜（Citrullus lanatusssp.vulgaris var.megakasperms Lin et Chao），葫蘆科，一年生蔓性草本，形狀與西瓜類似，多籽，含糖量低，因其習(xí)慣上以食用籽為主，故稱籽瓜[1-2]。籽瓜在我國種植面積廣泛，尤其在我國西北干旱地區(qū)為重要的經(jīng)濟(jì)作物[3]。由于籽瓜主要為籽用，長久以來，在籽瓜主產(chǎn)區(qū)都是以取籽為主，作為加工炒食制品的原料，而瓜瓤和瓜皮則丟棄不用，丟棄的瓜瓤和瓜皮占總質(zhì)量的65%～70%，致使籽瓜利用率低，而且造成了嚴(yán)重的浪費(fèi)[4]。

果膠存在于植物細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)，一般從蘋果、柑橘等果皮中提取[5-8]。果膠在乳品工業(yè)、釀造業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用，市場需求巨大[9-12]。果膠為多糖類大分子化合物，利用響應(yīng)面法優(yōu)化果膠提取的報道較多，大多數(shù)工藝中，一般以水為提取溶劑，輔以微波、加熱、超聲等方法，而植物中大分子極性化合物，如雜多糖、色素、蛋白質(zhì)等，均會出現(xiàn)共提取的問題，影響果膠產(chǎn)品的純度[13-15]。果膠純度一般用半乳糖醛酸含量來表示，含量越大表示純度越高[16]。本研究采用咔唑-硫酸比色法測定果膠中半乳糖醛酸含量，為了更好提高籽瓜皮中所提取果膠的純度，考察以水為提取溶劑條件下，提取溫度、提取時間和提取液pH值等因素對籽瓜皮中果膠提取的影響，并對提取條件進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，確定高純度果膠的最佳提取工藝參數(shù)，利用傅里葉變換紅外光譜對比分析了在優(yōu)化條件下所提取的籽瓜皮中果膠的純度，以期為籽瓜皮果膠的高效提取提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

籽瓜：采自甘肅白銀平川；高純果膠（半乳糖醛酸含量76%）：鄭州天順食品添加劑有限公司；濃鹽酸（分析純）、無水乙醇（分析純）、濃硫酸（分析純）：北京化工廠；D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技公司；咔唑（分析純）：上海中秦化學(xué)試劑有限公司；溴化鉀（色譜純）：Aladdin化學(xué)試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JA2003型精密電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器：金壇市順華儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱：杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；PHS-3C酸度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；722型可見分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；FTS3000型傅立葉變換紅外光譜儀：美國Digilab公司；XFB-200型粉碎機(jī)：湖南中誠制藥機(jī)械廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 籽瓜皮中果膠的提取

籽瓜皮的預(yù)處理：選取新鮮無腐的籽瓜皮，洗凈后切成小塊，然后在沸水中加熱煮沸8 min，再用50 ℃熱水淋洗2～3次，以除盡籽瓜皮內(nèi)的酶，自然風(fēng)干，將風(fēng)干后的籽瓜皮粉碎過100目篩封裝備用。

果膠提?。悍Q取30.0 g上述處理好的籽瓜皮粉末，按一定的料液比加入蒸餾水，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH，油浴恒溫一定時間提取果膠，趁熱過濾得濾液，再對殘渣進(jìn)行相同條件的二次提取。集合濾液減壓濃縮至200 mL，加入體積比1∶3的無水乙醇沉析過夜，析出果膠后離心收集，放入干燥箱中60 ℃干燥12 h，稱質(zhì)量備用。

1.3.2 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及含量測定

采用咔唑-硫酸法測定籽瓜皮果膠中的半乳糖醛酸的含量[17]。

（1）半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，蒸餾水溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成100 μg/mL的標(biāo)品溶液。各移取上述半乳糖醛酸溶液1～9 mL于10 mL容量瓶中，稀釋至10 mL，得到質(zhì)量濃度為10～90 μg/mL的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

（2）半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

移取不同質(zhì)量濃度的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL于具塞試管中，在冰水浴冷卻下，緩慢加入5.5 mL濃硫酸，沸水浴中加熱15 min后，降至室溫，再加入0.15%咔唑0.5 mL，充分混合（以蒸餾水代替半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，依上法同樣處理，作為對照空白）。室溫放置35 min后，利用分光光度計在波長530 nm處，分別測定其吸光度值，以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液中半乳糖醛酸的含量（x）為橫坐標(biāo)，制作半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）果膠半乳糖醛酸含量測定

準(zhǔn)確稱取籽瓜皮果膠樣品10 mg，配制成0.1%的果膠溶液，精確量取1 mL待測液，按照上述實驗步驟測定其吸光度值。通過上述繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算果膠中半乳糖醛酸的含量，其計算公式如下：

Y=A×V×N/W×100%

式中：Y為半乳糖醛酸含量，%；A為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的半乳糖醛酸質(zhì)量濃度，μg/mL；V為待測液的體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；W為果膠樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 果膠提取的單因素試驗和響應(yīng)面設(shè)計

（1）單因素試驗設(shè)計

以半乳糖醛酸含量為響應(yīng)值，分別研究提取溫度（73℃、78 ℃、83 ℃、88 ℃、93 ℃）、提取時間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min）、pH值（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0）和料液比（30∶1、27∶1、25∶1、23∶1、21∶1（g∶L））對籽瓜皮中所提取果膠的半乳糖醛酸含量的影響。

（2）Box-Behnken試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，以提取時間（A）、提取溫度（B）、提取液pH值（C）為影響因素，以籽瓜皮果膠中半乳糖醛酸含量（Y）為響應(yīng)值，確定籽瓜皮中果膠的最優(yōu)提取條件。因素與水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平編碼Table 1 Factors and levels of response surface design

1.3.4 傅里葉變化紅外光譜分析

利用傅立葉變換紅外光譜儀，比對市售果膠樣品和最佳工藝條件下提取的籽瓜皮中果膠的紅外光譜。各準(zhǔn)確稱取10 mg的果膠樣品，60 ℃干燥6 h，粉碎研細(xì)后，KBr壓片，掃描波數(shù)范圍400～4 000 cm-1，掃描時間0.5 min，掃描分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32。

2 結(jié)果與分析

2.1 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用咔唑-硫酸比色法測定不同質(zhì)量濃度的半乳糖醛酸在波長530 nm處的吸光度值，以半乳糖醛酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制出的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 半乳糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of galacturonic acid

由圖1可知，在0～90 μg/mL范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.005 8x-0.008 6，擬合系數(shù)R2=0.999 1，表明半乳糖醛酸含量與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2 籽瓜皮中果膠提取工藝的單因素試驗結(jié)果

圖2 提取溫度(A)、提取液pH值(B)、提取時間(C)和料液比(D)對果膠中半乳糖醛酸含量的影響Fig.2 Effects of extraction temperature (A),pH value (B),time (C) and solid-liquid ratio (D) on galacturonic acid content of pectin

由圖2可以看出，隨著提取溫度的升高，半乳糖醛酸含量顯著提高，在83 ℃時半乳糖醛酸含量達(dá)到最大值為69.5%，繼續(xù)升高溫度，半乳糖醛酸含量降低。這可能是因為過高的溫度會使果膠發(fā)生降解，導(dǎo)致半乳糖醛酸含量減少。因此，選擇提取溫度為83 ℃較為理想。

提取液pH值在1.0～1.5，隨著pH值的增大，半乳糖醛酸含量提高。pH值＞1.5之后，半乳糖醛酸含量顯著降低，表明果膠半乳糖醛酸存在一個較低的pH范圍內(nèi)，較高的pH不利于果膠半乳糖醛酸提取。因此，選擇提取液pH值為1.5較為理想。

提取時間在30～120 min，半乳糖醛酸含量逐漸提高，提取時間＞120 min，半乳糖醛酸含量下降?？梢?，提取時間過長，會使部分游離的果膠水解，造成果膠半乳糖醛酸含量降低。因此，選擇提取時間為120 min較為理想。

料液比在20∶1～30∶1（g∶L），半乳糖醛酸含量的變化不明顯，在料液比為23∶1（g∶L）時達(dá)到最大值69.3%，再繼續(xù)增大料液比，半乳糖醛酸含量開始減小，因此，選擇提取料液比為23∶1（g∶L）較為理想。

2.3 響應(yīng)面試驗

2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

從單因素試驗結(jié)果可知，其中料液比因素對半乳糖醛酸的含量影響較小，固定料液比為23∶1（g∶L），以提取時間，提取溫度及提取液pH值為因素設(shè)計響應(yīng)面試驗。按照試驗設(shè)計方案進(jìn)行響應(yīng)面試驗分析，其結(jié)果見表2，顯著性與方差分析結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken response surface experiment

表3 回歸模型顯著性與方差分析Table 3 Variance analysis and significance tests of regression model

利用Design-Expert 8.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，果膠半乳糖醛酸含量（Y）與各因素的回歸方程如下：

由表3看出，模型極顯著（P＜0.000 1），失擬檢驗的P值是0.085 0＞0.05，表明相對于純誤差失擬是不顯著的。擬合模型的R2=0.997 5，表明99.75%的變異來源于自變量。預(yù)測模型R2=0.994 2，表明試驗值與對應(yīng)的模型預(yù)測值之間高度一致，由此可知模型擬合良好，可用該回歸模型代替試驗真實點(diǎn)對試驗結(jié)果進(jìn)行分析。

分析表3可知，各因素對果膠半乳糖醛酸含量影響排序為C（pH值）＞B（溫度）＞A（時間）。其中對果膠半乳糖醛酸的含量影響極顯著的是B、C、AB、BC、A2、B2、C2，顯著的是AC。

2.3.2 單因素交互作用

考察各因素之間相互關(guān)系對籽瓜皮果膠中半乳糖醛酸含量的影響，通過Design-Expert 8.0軟件對各因素之間的交互作用進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制響應(yīng)面曲線圖和等高線圖，結(jié)果見圖3。

由圖3A可以看出，提取溫度在低水平時，延長提取時間能提高果膠半乳糖醛酸含量，提取溫度在高水平時，加熱較短的時間就能獲得較高的半乳糖醛酸含量，其曲面較為平緩。

由圖3B可以看出，提取溫度和提取液pH值兩個因素間有較強(qiáng)的交互作用，其曲面較陡，提取溫度為78～88 ℃及提取液pH值為1.0～1.5 時，果膠半乳糖醛酸含量達(dá)到較高值，當(dāng)二者水平過高或過低都會使果膠半乳糖醛酸含量下降，提取液pH值和提取溫度應(yīng)有各自適宜的水平范圍。

由圖3C可以看出，提取時間和提取液pH值與半乳糖醛酸含量呈拋物線關(guān)系，曲面也較為陡，在一定范圍內(nèi)隨著時間延長和pH值升高，半乳糖醛酸含量增大，達(dá)到最大值后，繼續(xù)延長提取時間和提高提取液pH值，半乳糖醛酸含量呈下降趨勢。

圖3 提取溫度、提取時間和提取液pH值的交互作用對果膠中半乳糖醛酸含量影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.3 Response surface plots and contour line of effects of interactions between extraction time,temperature and pH value on galacturonic acid content of pectin

2.3.3 模型驗證

運(yùn)用Design-Expert 8.0確定的最佳提取工藝為提取溫度88 ℃，提取時間147 min，提取液pH值為1.64，在此條件下，果膠中半乳糖醛酸含量的的預(yù)測值為78.10%?？紤]到操作的方便性，確定的最佳工藝條件為提取溫度88 ℃，提取時間150 min，提取液pH值為1.6，在此條件下，果膠中半乳糖醛酸含量的的預(yù)測值78.03%。采用上述條件進(jìn)行模型驗證，試驗重復(fù)5次，所得籽瓜皮果膠中半乳糖醛酸含量平均值為76.65%，與理論預(yù)測值擬合較好，可見該模型能較好地模擬與預(yù)測提取工藝條件對果膠中半乳糖醛酸含量的影響。

2.4 紅外光譜比對分析

圖4 不同果膠的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrogram of different pectin

由圖4可以看出，由于果膠為多糖類化合物，其中含有大量的羥基，其中在波數(shù)范圍3 700～3 000 cm-1出現(xiàn)的寬峰為羥基O-H振動的結(jié)果；果膠中半乳糖醛酸甲酯的部位在波數(shù)2 900～2 700 cm-1之間產(chǎn)生O-CH3的伸縮振動；波數(shù)1 627 cm-1和1 743 cm-1處分別為羧基官能團(tuán)和酯化羧基官能團(tuán)中C=O的吸收峰[18]。經(jīng)比較，采用優(yōu)化工藝從籽瓜皮中所提取果膠與商售高純果膠產(chǎn)品紅外圖譜峰型與豐度較一致，產(chǎn)品對比具有較好的相似性。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面分析法，優(yōu)化了籽瓜皮中果膠提取工藝，即水溶劑條件下，提取溫度88 ℃，提取時間150 min，提取液pH值為1.6，料液比為23∶1（g∶L）。該條件下提取的果膠半乳糖醛酸含量較高，均值為76.65%，與理論預(yù)測值（78.03%）擬合良好，實驗的重現(xiàn)性好。所提取果膠符合市場規(guī)定的半乳糖醛酸含量≥65%的標(biāo)準(zhǔn)[19]。利用傅里葉變換紅外光譜比對分析表明，市售高純果膠產(chǎn)品與本研究所提取的果膠紅外光譜圖吻合度高，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可運(yùn)用于實踐。

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