定喘止哮顆粒對(duì)哮喘豚鼠模型支氣管肺泡灌洗液中IL-4和IL-13水平的影響※

仕　麗　羅　威　徐燕南　張麗秀　于秀華　王　檀

定喘止哮顆粒對(duì)哮喘豚鼠模型支氣管肺泡灌洗液中IL-4和IL-13水平的影響※

仕麗1羅威2徐燕南1張麗秀1于秀華1王檀1

（1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肺病內(nèi)科，長(zhǎng)春130021；2長(zhǎng)春市傳染病院中西醫(yī)結(jié)合科，長(zhǎng)春130123）

摘要：目的研究定喘止哮顆粒對(duì)哮喘豚鼠模型支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-4、IL-13水平的影響。方法采用10%卵蛋白（OVA）肌肉注射、超聲霧化吸入致敏建立支氣管哮喘豚鼠模型。造模后隨機(jī)分為模型組，陽(yáng)性對(duì)照藥氨茶堿0.025 g/kg組及定喘止哮顆粒4、2、1 g/kg三個(gè)劑量組，另外10只為空白對(duì)照組。治療4周后，觀察各組豚鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IL-13的含量。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組BALF的IL-4、IL-13明顯增加（P＜0.01）。定喘止哮顆粒三個(gè)劑量組與模型組相比支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IL-13均有不同程度下降，即定喘止哮顆粒可降低BALF的IL-4、IL-13水平，且劑量越大此作用越明顯。結(jié)論定喘止哮顆?？梢允笽L-4、IL-13水平明顯降低（P＜0.01），通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞之間的功能平衡，達(dá)到拮抗氣道炎癥的作用，且作用強(qiáng)度與藥物劑量有關(guān)。

關(guān)鍵詞：定喘止哮顆粒；支氣管哮喘；肺泡灌洗液；IL-4、IL-13；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2014年《全球哮喘防治創(chuàng)議》［1］（GINA）中提出支氣管哮喘，簡(jiǎn)稱哮喘（bronchial asthma）是一種慢性呼吸道異質(zhì)性疾病，以慢性氣道炎癥為核心，由多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞組分參與，是目前世界上最常見的慢性疾病之一。全球約有3億患者，我國(guó)平均患病率為0.5%～1.0%，其發(fā)病率和病死率呈逐年攀升趨勢(shì)。本病的發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜，其中Th1/Th2細(xì)胞失衡被認(rèn)為是哮喘免疫學(xué)發(fā)病的重要基礎(chǔ)，因此，糾正Th1/Th2失衡狀態(tài)是治療哮喘的關(guān)鍵。IL-4則被視為機(jī)體Th1/Th2細(xì)胞失衡的重要信號(hào)因子之一。研究表明，哮喘支氣管肺泡灌洗液中TGF-β和IL-13的水平顯著升高［2］。IL-13作為Th2細(xì)胞分泌的多效應(yīng)細(xì)胞因子，是哮喘氣道重塑過(guò)程的重要參與者［3］。目前，針對(duì)這些對(duì)氣道慢性炎癥具有特殊作用的細(xì)胞因子已展開深入研究，如阻斷IL-4/IL-13［4］、IL-33［5］、IL-35［6］等。我們?cè)谂R床中應(yīng)用中藥定喘止哮顆粒治療支氣管哮喘患者由于內(nèi)風(fēng)導(dǎo)致發(fā)作，取得較好療效，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)復(fù)制哮喘豚鼠模型，觀察定喘止哮顆粒對(duì)哮喘豚鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IL-13水平的影響，研究其對(duì)氣道炎癥的作用，探討中藥定喘止哮顆粒治療支氣管哮喘的作用機(jī)理。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1主要試劑卵清蛋白（Sigma公司）；白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-5（IL-5）ELISA試劑盒、γ-干擾素(IFN-γ)ELISA試劑盒（美國(guó)RB公司）。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科研試驗(yàn)用豚鼠，雌雄各半，體重250～350 g。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(吉)-2012-0002，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.1.3藥品定喘止哮顆粒，批號(hào)：20121008，長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)提供；陽(yáng)性對(duì)照藥氨茶堿片，規(guī)格：0.1 g/片，批號(hào)：B120703，山西云鵬制藥有限公司產(chǎn)品；甲醛溶液，規(guī)格：分析純，500 ml/瓶，批號(hào)：20090419，沈陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)試劑廠產(chǎn)品。

1.1.4儀器生理信號(hào)采集系統(tǒng)，型號(hào)：Powerlab/8sp，澳大利亞埃德公司產(chǎn)品；賀利氏（Heraeus）臺(tái)式離心機(jī)Stratos，型號(hào)：Biofuge Stratos，德國(guó)賀利氏公司產(chǎn)品；電子天平，型號(hào)：BSA224S，北京賽多利斯公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，型號(hào)：BIO680，美國(guó)伯樂(lè)公司產(chǎn)品；醫(yī)用超聲霧化吸入器，上海醫(yī)療器械廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法[7，8]

1.2.1動(dòng)物分組取體質(zhì)量250～350 g豚鼠60只，雌雄兼用，隨機(jī)分為6組，每組10只。

1.2.2造模方法除對(duì)照組動(dòng)物外，其他組動(dòng)物用10%卵蛋白肌肉注射致敏，4周后，將豚鼠置于密閉有機(jī)玻璃箱中，用1%卵蛋白超聲霧化吸入2 min進(jìn)行攻擊。

1.2.3給藥方法陽(yáng)性對(duì)照藥組：氨茶堿0.025 g/kg，定喘止哮顆粒組：4、2、1 g/kg三個(gè)劑量。均于致敏同時(shí)灌胃給藥，空白對(duì)照組給予同體積的蒸餾水。

1.2.4檢測(cè)項(xiàng)目各組分別于給藥4周后，除正常組外，各組激發(fā)哮喘后即處死，以生理鹽水行全肺灌洗，充分回收，反復(fù)3次，制備肺泡灌洗液約2 mL，離心去取上清液-70℃冰箱保存。用ELISA法測(cè)定肺泡灌洗液中的IL-4、IL-13含量。

1.3統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，結(jié)果以采用組間t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

在本研究中，與對(duì)照組比較，哮喘模型組豚鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-13含量明顯增高，有顯著性差異（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組豚鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-13水平明顯下降，有顯著性差異（P＜0.01）。定喘止哮顆粒4、2、1 g/kg三個(gè)劑量組均能抑制支氣管哮喘模型豚鼠肺泡灌洗液的IL-4、IL-13含量，劑量越大此作用越明顯。詳細(xì)結(jié)果見表1。

表1　定喘止哮顆粒對(duì)哮喘豚鼠模型支氣管肺泡灌洗液中IL-4和IL-13水平的影響(x±s，n=10)

3　討論

支氣管哮喘屬于中醫(yī)學(xué)“哮證”“喘證”范疇，具有發(fā)作性的特點(diǎn)和痰鳴氣喘、哮鳴有聲的臨床表現(xiàn)，甚者呼吸困難、不能平臥。哮喘發(fā)病率增高，目前認(rèn)為哮喘為身心疾病，隨病程延長(zhǎng)由外源性誘因誘發(fā)的發(fā)作漸已淡化，情緒等內(nèi)源因素在其發(fā)作中有重要的作用。課題組認(rèn)為肝陽(yáng)偏亢，內(nèi)風(fēng)上逆沖肺，則貫穿哮病發(fā)作期的始終。其發(fā)作時(shí)證候特點(diǎn)：喘息，喉中哮鳴有聲，伴咳嗽，咯痰，胸膈滿悶，情緒不寧，心煩易怒，腰膝酸軟，面色潮紅，舌紅苔黃膩，脈弦。故認(rèn)為本病中老年患者內(nèi)源性發(fā)病基礎(chǔ)為：腎精不足，水不涵木，陰不斂陽(yáng)，肝陽(yáng)偏亢，虛陽(yáng)浮動(dòng)，生風(fēng)迫肺，故作哮喘。針對(duì)此類患者急性發(fā)作期治療立熄風(fēng)定喘止哮為法，制定喘止哮顆粒臨床應(yīng)用效果較好，且不易復(fù)發(fā)。

哮喘的發(fā)病機(jī)制：Th1/Th2功能失衡，Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)可導(dǎo)致哮喘發(fā)作。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等，誘發(fā)肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）生長(zhǎng)分化以及包括IgE在內(nèi)的免疫球蛋白生成。IL-4可能在哮喘早期起作用，而IL-13可能在哮喘的維持和發(fā)展中起重要作用［9］。IL-4是Th2細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子。IL-4能促進(jìn)B細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)并產(chǎn)生IgE，放大且增加IgE的產(chǎn)生和效應(yīng)，從而間接或直接誘導(dǎo)產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性及炎癥。IL-4還可促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為Th2細(xì)胞，并抑制Th1細(xì)胞的效應(yīng)。IL-13是Th2細(xì)胞分泌的多效應(yīng)細(xì)胞因子，可以不斷激活機(jī)體內(nèi)的嗜酸性粒細(xì)胞，并抑制其凋亡，同時(shí)可直接促使B細(xì)胞分化，增加IgE分泌，進(jìn)而廣泛地參與到哮喘發(fā)病的整個(gè)過(guò)程，提升哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)性［10、11］。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，定喘止哮顆?？梢允笽L-4、IL-13水平明顯降低。定喘止哮顆粒通過(guò)對(duì)IL-4、IL-13的拮抗作用，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞的功能平衡，降低氣道炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到緩解哮喘的發(fā)作，充分發(fā)揮了中藥制劑調(diào)節(jié)機(jī)體動(dòng)態(tài)平衡的優(yōu)勢(shì)，且副反應(yīng)小，有良好的臨床價(jià)值。

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科合字[2013]第87號(hào)）

doi:10.3969/j.issn.1672-2779.2015.18.073

文章編號(hào)：1672-2779（2015）-18-0142-02

收稿日期：（本文編輯：張文娟本文校對(duì)：楊海淼2015-08-13）

基金項(xiàng)目：※吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（No：吉教

SHI Li1， LUO Wei2， XU Yannan1， ZHANG Lixiu1， YU Xiuhua1， WANG Tang1
(1. Department of Integrated Medicine， Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine， Changchun 130021，China；2. Department of Integrated Medicine， Changchun City Hospital of Infectious Diseases， Changchun 130123， China)

Abstract：Objective To investigate the Effectof Dingchuan Zhixiao granule on the levelof IL-4 and IL-13 in bronchoalveolar lavage fluid of the asthmamodelguinea pig.M ethods Guinea pigmodelof bronchial asthma wasestablished adopting 10% OVA muscle injection and ultrasonic atomizing inhalation.They were random ly divided into model group,The positive control drug aminophylline 0.025 g/kg group, three Dingchuan Zhixiao granule groups(4 g/kg,2 g/kg and 1 g/kg),and 10 cases in blank controlgroup.After 4 weeks＇ treatment,contents of IL-13 and IL-4 in bronchoalveolar lavage fluid were observed.Results Comparimg with control group,the IL-4 and IL-13 in bronchoalveolar lavage fluid of themodel group increased significantly(P＜0.01).Comparing with themodel group,the IL-4 and IL-13 in bronchoalveolar lavage fluid of the three Dingchuan Zhixiao granule groupshad differentdegreesof decline.Dingchuan Zhixiao granule can reduce the level of IL-13 and IL-4 in bronchoalveolar lavage fluid,and the higher the dose,the more obvious the effect.Conclusion Dingchuan Zhixiao granule can reduce the level of IL-13 and IL-4 in bronchoalveolar lavage fluid significantly,by regulating the function of Th1/Th2 cells,the function of the airway inflammation is reached,and the intensity ofaction is related to the dose.

Keywords：Dingchuan Zhixiao granule；bronchial asthma；bronchoalveolar lavage fluid；IL-4；IL-13；animal experiment