高通量測序數(shù)據(jù)分析和臨床診斷流程的解讀

黎籽秀 劉 博 徐凌麗 楊 琳 王慧君 周文浩

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高通量測序數(shù)據(jù)分析和臨床診斷流程的解讀

黎籽秀1劉 博2徐凌麗3楊 琳3王慧君4周文浩4

高通量測序技術也稱二代測序技術，可以一次對幾十至幾百萬條短序列片段同時進行測定。該技術的出現(xiàn)使研究者可以對一個物種的基因組、轉錄組和表觀遺傳組進行全面的分析?；蚪M二代測序可用于對全基因組、全外顯子組或感興趣的特定區(qū)域進行序列測定。通常，基因組二代測序的目的是檢測個體基因組范圍內的遺傳變異，包括單堿基變異(SNVs)、插入缺失變異(Indels)、拷貝數(shù)變異(CNVs)和結構變異(SVs)，并最終篩選出致病突變[1]。

近年來，基因組二代測序開始逐步應用于臨床分子診斷[2～8]，不僅能幫助醫(yī)生明確患者的遺傳學病因，指導治療及判斷預后，更重要的是可為遺傳咨詢提供明確的指導。根據(jù)患兒及其父母的遺傳信息，可判斷患兒致病成因是新生突變還是遺傳于父母，以此評估父母生育下一胎時的疾病遺傳風險，對家庭的“優(yōu)生”提供更好的指導。

基因組二代測序技術與傳統(tǒng)分子檢測技術不同，可以同時對大量基因進行檢測，一次性獲得海量的數(shù)據(jù)。因此，構建一個基于遺傳性疾病診斷需要的基因組二代測序數(shù)據(jù)分析流程，以期從眾多變異中篩選出潛在致病突變，顯得尤為重要。復旦大學附屬兒科醫(yī)院轉化醫(yī)學中心團隊在美國貝勒醫(yī)學院人類與分子遺傳系的學習、交流和指導下，通過參閱既往數(shù)據(jù)分析相關文獻[1,2,9]以及建立流程的實際經(jīng)驗，建立一套高通量測序數(shù)據(jù)分析和臨床診斷流程(圖1)，包括測序數(shù)據(jù)預處理及變異檢測、變異注釋、變異篩選和變異分類等，清晰地向臨床醫(yī)生展現(xiàn)了變異篩選過程的概況，使研究者聚焦到更具有生物學意義、臨床相關的變異，并為國內開展基于基因組二代測序技術的遺傳性疾病診斷思考提供了基本路線圖。復旦大學附屬兒科醫(yī)院轉化醫(yī)學中心應用該流程分析了87例多發(fā)畸形患兒的WES數(shù)據(jù)，得到的候選變異經(jīng)由遺傳專科醫(yī)生進行分析，檢出的陽性率為25%，與目前認為WES的檢出陽性率一致。

圖1 高通量測序數(shù)據(jù)分析和臨床診斷流程

1 測序數(shù)據(jù)預處理及變異檢測

基因組二代測序初始數(shù)據(jù)是由熒光或電信號組成的圖像信息，圖像信息可通過相應測序平臺提供的軟件經(jīng)堿基識別(Base Calling)轉化成FASTQ或FASTA格式的原始序列數(shù)據(jù)(Raw data)。Raw data去除接頭以及低質量的讀序后，采用BWA軟件[10]將其定位到人類基因組的參考序列上，通過picard

(http://picard.sourceforge.net)和SAMtools軟件[10]將建庫過程中由于PCR擴增產生的冗余信息去掉。最后用GATK[11,12]檢測變異，包括SNVs和Indels。目前，測序數(shù)據(jù)預處理及變異檢測已形成較為成熟的生物信息分析流程。大多數(shù)測序公司均能提供完成此流程的服務。

2 注釋

基因組二代測序技術產生了大量的遺傳變異數(shù)據(jù)，其中僅少數(shù)變異具有功能意義。為了從眾多變異中鎖定可能的致病突變，需要從不同層面對變異進行注釋。注釋過程主要通過ANNOVAR和VEP(Variant Effect Predictor)軟件及自行添加進行注釋。

ANNOVAR[13]是第一個對遺傳變異進行注釋的軟件。經(jīng)過ANNOVAR 的注釋，可對變異有多層面的了解，便于對其進行后續(xù)篩選。ANNOVAR對變異的注釋包括以下3個方面，①基因的注釋：注釋信息包括變異類型，引起蛋白質一級結構改變的情況等?？梢造`活地使用RefSeq基因、UCSC基因、ENSEMBL基因、GENCODE基因或其他基因定義系統(tǒng)進行位點-基因定位注釋；②區(qū)域的注釋：對變異位點所處的基因組環(huán)境進行注釋，位點的基因組環(huán)境包括位點的保守性、轉錄因子、非轉錄RNA結合強弱和表觀遺傳標記物靶向性等信息；③過濾的注釋：其注釋結果可對變異進行后續(xù)篩選，包括變異在不同群體頻率的注釋，變異位點在dbSNP的注釋，位點對蛋白質三維結構影響預測的注釋，位點與疾病關聯(lián)的注釋。

VEP[14]是Ensembel和Ensembel基因組最常用的工具之一，用以研究變異對基因、轉錄本、蛋白質和調控區(qū)域所造成的影響。

雖同為變異注釋軟件，但VEP與ANNOVAR存在區(qū)別，①ANNOVAR選用NCBI的RefSeq參考序列注釋，VEP選用Ensembl的轉錄本集合作為參考序列注釋；②注釋策略存在差異，ANNOVAR注釋為同義突變的位點，VEP可能將其注釋為錯義突變。因此，2個注釋軟件針對同一個變異的注釋結果可進行相互補充。

除使用上述2個軟件進行注釋外，還有諸如蛋白質序列數(shù)據(jù)庫(Swiss-Prot)、人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)以及內部數(shù)據(jù)庫(in-house database)等提供的重要參考信息需要人工添加進行注釋。

2.1 基因注釋參考的數(shù)據(jù)庫

2.1.1 The Reference Sequence(RefSeq) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/。RefSeq是美國國家生物信息技術中心(NCBI)提供的具有生物學意義的非冗余的DNA、RNA和蛋白質參考序列數(shù)據(jù)庫。RefSeq為基因注釋，突變及多態(tài)性分析，基因表達研究等提供了重要的參考標準[15]。RefSeq提供了基因的染色體號、基因所在染色體位置、基因轉錄起始終止位點、翻譯起始終止位點和各個外顯子的起始終止位置等信息。使用RefSeq對變異位點進行基因注釋可明確發(fā)生變異的基因，變異所處基因功能區(qū)域，變異類型以及氨基酸改變的情況。

2.1.2 蛋白質序列數(shù)據(jù)(Swiss-Prot) http://www.uniprot.org/。Swiss-Prot是一個人工注釋的、非冗余的蛋白質序列數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫中的所有條目均由分子生物學家和蛋白質化學家通過計算機工具預測并查閱相關文獻進行仔細核實。Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫是目前最全面的注釋蛋白質序列庫，其目的是對蛋白質提供全面的已知相關信息。許多序列分析軟件被用于Swiss-Prot條目注釋。軟件分析結果通過人工評估后，被選擇性地加入條目注釋中。數(shù)據(jù)庫中每個條目均有詳細的注釋，包括蛋白質、基因名字、蛋白質功能、表達模式、結構域、功能位點、跨膜區(qū)域、二硫鍵位置、翻譯后修飾、突變體及其與疾病的關系等。Swiss-Prot目前包含547 357例條目，并與其他30多個數(shù)據(jù)庫交叉引用，例如PDB、OMIM和PROSTITE等。

2.2 變異/基因與疾病關系注釋參考的數(shù)據(jù)庫

2.2.1 人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)[16]http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php。HGMD由英國卡爾地夫醫(yī)學遺傳研究所構建。HGMD用計算機和手工結合的方法從已發(fā)表在期刊中收集與人類遺傳疾病相關的突變信息，是目前收錄人類突變信息最全的數(shù)據(jù)庫。截至2014年12月18日，HGMD收錄疾病相關變異的數(shù)量在免費版本中為108 508個，在專業(yè)版本中為156 932個[17]。HGMD中記錄的突變信息包括突變類型列表、對應的疾病列表和相應的參考文獻。其中突變類型包括在編碼區(qū)、調控區(qū)和剪接區(qū)域中的大片段插入缺失、微片段插入缺失、基因組重組、重復變異、致病點突變、致病點移碼、致病點無義、影響可變剪接的變異和與疾病相關的多態(tài)性位點，包括在所研究的疾病組和對照組差異有統(tǒng)計學意義的位點和已被報道能影響基因表達或蛋白質結構和功能的位點。HGMD的免費版本只能在線查找基因變異信息[16]。

HGMD根據(jù)變異位點和疾病的關聯(lián)程度以及位點的突變類型等信息對位點進行分類，包括①致病突變(DM)，即目前認為該突變能直接導致疾??；②疑似致病突變(DM?)，即該變異曾被認為是致病突變，但基于基因組/群體篩查或其他發(fā)現(xiàn)該突變可能與病理無關或為中性突變。隨著突變信息的累積，若該變異被確認不是DM，可能會被徹底從數(shù)據(jù)庫刪除; ③疾病相關的多態(tài)性變異(DP)，即疾病/表型顯著相關的多態(tài)性位點，根據(jù)位點復制、進化保守性等信息認為這些變異有一定的功能，但目前尚無功能實驗證實(如表達研究);④有功能證據(jù)支持的疾病相關多態(tài)性變異(DFP)，即有功能實驗證實(如：表達結果改變，mRNA研究等)的疾病/表型顯著相關的多態(tài)性位點；⑤體外/實驗室或體內功能的多態(tài)性變異(FP)，即影響一個基因(或基因產物)的結構、功能或表達，但目前尚未報道與疾病關聯(lián)的多態(tài)性位點；⑥移碼或truncating變異(FTV)，即被預測能引起基因編碼蛋白質的改變或截短，但目前未報道與疾病關聯(lián)或致病的變異。

DP、DFP、FP和FTV類型的變異約占HGMD報道變異的5.5%，同時，這4種類型的變異直接致病性證據(jù)不強，所以WES流程篩選罕見遺傳性疾病的致病突變時應當優(yōu)先關注DM和DM?。

2.2.2 在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM)[18]http://omim.org/。OMIM是由美國約翰霍普金斯大學于1968年建立的關于人類基因和基因突變的數(shù)據(jù)庫。每日更新以提供全面而權威的基因遺傳和疾病表型信息，截至2014年12月15日，OMIM數(shù)據(jù)庫收錄了22 700個詞條；分子基礎已知的表型有5 369個，疾病基因有3 309個。OMIM條目包括基因和突變的文字描述、病例記錄、分子診斷、參考文獻和與其他數(shù)據(jù)庫的鏈接。

區(qū)別于HGMD提供基因所有的變異位點信息，大多數(shù)OMIM基因更關注疾病基因的第一個突變，對應表型最常見的突變以及具有不尋常特征的突變，包括特殊突變類型，特殊突變致病機制，特殊突變遺傳模式(如在相同基因中，部分突變?yōu)轱@性遺傳模式，部分為隱性遺傳模式)等。除此之外，OMIM提供較為全面的疾病臨床表型譜，為臨床醫(yī)生和研究者根據(jù)患者的表型信息對診斷疾病提供依據(jù)[19]。

OMIM數(shù)據(jù)庫存儲的疾病信息以孟德爾遺傳病為主，近年來也收錄了許多復雜疾病以及復雜疾病易感的多態(tài)性位點等信息[20]。因此，在研究罕見遺傳疾病時，需要對OMIM數(shù)據(jù)庫中的疾病分等級對待，具有OMIM號的單基因疾病優(yōu)先被考慮。

2.2.3 Clinvar[21]http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/。為了促進和加速對基因型與表型之間關系的研究，NCBI于2013年4月正式啟動ClinVar公共免費數(shù)據(jù)庫。ClinVar數(shù)據(jù)庫旨在整合NCBI以及各種遺傳變異和臨床表型數(shù)據(jù)庫，通過標準的命名法來描述疾病，將變異、臨床表型、實證數(shù)據(jù)和功能注解與分析4個方面的信息，通過專家評審，逐步形成一個標準的、可信和穩(wěn)定的遺傳變異-臨床表型相關的數(shù)據(jù)庫。

ClinVar數(shù)據(jù)庫與其他“變異/基因-疾病”數(shù)據(jù)庫的重要區(qū)別在于該數(shù)據(jù)庫有一系列的專家小組對大量數(shù)據(jù)進行評估和歸納，能更好地理解基因型和重要表型之間的關系。對于感興趣的變異，ClinVar除了列舉突變類型，突變與疾病對應關系等基本信息外，還包括該變異的臨床意義(分為9個類別，其中類別4和5在尋找罕見遺傳性疾病候選突變時應優(yōu)先考慮)，專家對變異與疾病關聯(lián)可信度的評價(分為4星級，變異和疾病的關聯(lián)可信度達到3星級以上則表明該變異已通過專家小組的評估審核，可明確變異和疾病存在關聯(lián)性)。2.3 突變頻率注釋參考的數(shù)據(jù)庫

2.3.1 千人基因組計劃(1000 Genome Project) http://www.1000genomes.org/ ?！扒嘶蚪M計劃”是2008年初由英國Sanger研究所、美國國立人類基因組和中國華大基因研究所共同啟動的、以二代測序技術為主導的人類基因組計劃三期工程。千人基因組的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，每個人平均攜帶250～300個未報道過的變異，其中50～100個變異與遺傳病有關[22]。千人基因組計劃項目的開展，不僅加速了對常見疾病易感性基因的發(fā)現(xiàn)，還將加深對人類基因組結構差異的認識，為解釋人類重大疾病的發(fā)病機制，開展疾病個性化預測、預防和治療奠定了基礎。千人基因組計劃完成了基因組科學從基礎向應用過渡的關鍵戰(zhàn)略轉移，有效地推進了臨床轉化醫(yī)學的興起和發(fā)展[23]。

2.3.2 The Exome Aggregation Consortium(ExAC) http://exac.broadinstitute.org/。ExAC是一個專門研究外顯子組測序數(shù)據(jù)的聯(lián)盟機構，整合了多個外顯子組測序計劃。截止于2014年12月3日，數(shù)據(jù)庫收錄了91 796個樣本的外顯子測序數(shù)據(jù)，其中包括61 486個獨立樣本的數(shù)據(jù)。為了更好地統(tǒng)計變異頻率，ExAC使用相同的測序數(shù)據(jù)預處理及變異檢測分析流程對外顯子測序數(shù)據(jù)進行處理，即以GRCH37/hg19基因組作為人類基因組參考序列，用dbSNP135對變異進行注釋。ExAC是目前收錄不包含嚴重兒童疾病樣本的最大數(shù)據(jù)庫，因此該數(shù)據(jù)庫能更好地作為研究兒童孟德爾遺傳病的對照[24]。

2.4 變異預測注釋參考的軟件

2.4.1 SIFT(Sorting Intolerant From Tolerant)[25,26]http://sift.jcvi.org/。SIFT是一種基于序列同源性對氨基酸的替換容忍度進行評分，以預測氨基酸替換是否影響表型的軟件。2001年，Ng和Henikoff發(fā)現(xiàn)重要的氨基酸位點在蛋白質家族序列中較為保守，這些保守位點上發(fā)生的氨基酸替換更有可能影響蛋白質功能?；谠摷僭O，Ng和Henikoff采用位置相關評分矩陣(PSSM)來描述序列保守性信息[27]，開發(fā)了預測錯義突變對蛋白質功能影響的軟件SIFT。SIFT分數(shù)歸一化后范圍為0～1，其中，分數(shù)<0.05是有害替換(Deleterious)，≥0.05是可容忍的替換(Tolerate)。值得注意的是，應用SIFT軟件對錯義突變進行功能預測的前提是必須有足夠的同源序列，否則其預測精度將下降，甚至無法進行預測[28]。

2.4.2 Polyphen-2 (Polymorphism Phenotyping v2)[29]http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/。Polyphen-2是通過整合蛋白質序列和蛋白質三維結構特征，來預測人類蛋白質的氨基酸替換對結構和功能影響的軟件。采用貪婪迭代算法，從19個基于序列和13個基于結構的特征中，自動選取了8個基于序列和3個基于結構的特征來進行預測。其中序列特征包括變異位點所處于在蛋白質結構域(Pfam)的位置信息，是否導致CpG位點發(fā)生轉換(Transition)等，蛋白質結構特征包括溶劑可及性、SNP位點在 β鏈或活動區(qū)域的位置等。該方法有較高敏感度和特異度的前提是有可靠的蛋白質結構信息進行參考。Pholyphen-2有HumVar和HumDiv兩種模型。在對于孟德爾遺傳病的診斷分析中，HumVar模型產生的分數(shù)更適用于診斷。運行Pholyphen-2算法進行打分后，分數(shù)的范圍為0～1。分數(shù)越高的替換意味著有越大的破壞蛋白功能的可能，如果分數(shù)在0.957～1，其相應的預測結果為“probably damage”，在0.453～0.956為“possible damage”，在0～0.452為“benign”。

2.4.3 MutationTaster[30]http://www.mutation-taster.org/。MutationTaster是通過使用進化保守性、剪切位點改變和mRNA水平的變化引起的蛋白質特征丟失等信息，來評估序列變異帶來的致病可能性的軟件。HGMD專業(yè)版本中提供的390 000個已知致病突變位點信息作為陽性數(shù)據(jù)集，千人基因組計劃中>6 800 000個無致病突變的多態(tài)性信息作為陰性數(shù)據(jù)集，用貝葉斯分類算法對陰、陽性數(shù)據(jù)集建模，對感興趣的位點進行預測，預測結果的分數(shù)為0～1，分數(shù)越高意味著致病可能性越大，根據(jù)預測提示的分數(shù)及先驗信息校正后，軟件會對變異的致病可能性進行分類，具體說明如下：①A:disease_causing_automatic，變異在ClinVar中標記為致病性或者該變異是導致終止密碼子提前的無義突變；②D: disease_causing，變異被軟件預測為致病性突變；③N: polymorphism，變異被軟件預測為多態(tài)性；④P: polymorphism_automatic，變異在HapMap數(shù)據(jù)中存在3種基因型 AA、AB和BB或在千人基因組計劃數(shù)據(jù)集中顯示純合突變頻數(shù)>4。

3 篩選

3.1 質量控制 針對某個特定位點，若覆蓋該位點的讀序總數(shù)小于覆蓋該位點變異和未變異堿基的讀序數(shù)目之和，則表明該位點的質量未達標，應將其去除。該篩選過程可將小部分的SNVs和約一半的Indels篩除。

3.2 頻率篩選 基因變異程度可根據(jù)最小等位基因頻率(MAF)進行劃分。MAF值5%～50%的變異為常見變異，1%～5%為少見變異，<1%則為罕見變異[31]。基于罕見疾病是由罕見變異所導致的這一假說，在研究罕見疾病的致病變異時，應去除非罕見變異。

基于變異頻率的篩選方式為：① 變異已被HGMD報道，表明該變異更有可能與疾病相關，此時將注釋的公共數(shù)據(jù)庫的變異頻率篩選閾值設置為5%。②變異未被HGMD報道，此時將注釋的公共數(shù)據(jù)庫的變異頻率篩選閾值設置為1%[2]。③如果研究機構擁有收錄不同疾病患者信息的內部數(shù)據(jù)庫，若變異在內部數(shù)據(jù)庫10%的家系中出現(xiàn)，則應當去除該變異；當內部數(shù)據(jù)庫中無關個體數(shù)量達到1 000例時，篩選閾值可降至4%。使用內部數(shù)據(jù)庫的優(yōu)勢在于：一方面內部數(shù)據(jù)庫位點的變異頻率更符合中國人群的變異頻率，另一方面可去除由相同測序平臺導致的系統(tǒng)誤差。

3.3 分類篩選 根據(jù)所處基因組位置的不同，可將變異分為編碼區(qū)變異和非編碼區(qū)變異。研究發(fā)現(xiàn)，85%的致病突變都位于編碼區(qū)中，其中絕大部分位于外顯子上；極少數(shù)位于內含子上，可通過影響基因的可變剪接致病[32]。沒有被HGMD報道的位于非編碼區(qū)的變異，或者距離外顯子區(qū)>5 bp的內含子變異(不能影響mRNA的剪接)被篩選掉[2]。

保留下來的突變，根據(jù)突變對蛋白質序列影響的不同，可以分為同義突變、錯義突變、無義突變、終止密碼突變、剪接位點突變、移碼突變和整碼突變。無義突變、剪接位點突變和移碼突變被稱為truncating突變，能造成蛋白質缺失。同義突變不會引起蛋白質一級結構的改變，整碼突變與終止密碼突變雖然一定程度上改變蛋白質一級結構，但由于保留了基因閱讀框的次序，所以一般情況下不會造成蛋白質的功能缺陷。因此，尋找罕見疾病的候選致病突變優(yōu)先考慮能引起蛋白質功能缺陷的變異。

4 變異分類

本文通過參閱ACMG(American College of Medical Genetics)[33]對變異的分類標準，并結合實際研究經(jīng)驗，基于基因是否在OMIM/HGMD中被報道為致病基因，同時考慮突變頻率和類型，既往報道和臨床表現(xiàn)，根據(jù)變異的臨床可信度對變異進行分類。

4.1 已報道致病突變位點 已經(jīng)被報道為致病突變，并且既往報道該變異導致疾病的表型譜和患者的臨床表型相符。

4.2 新突變但預測為致病突變 包括無義突變、終止密碼突變、起始密碼子(ATG)突變、移碼突變和剪接供體/受體突變。

4.3 新突變致病性不明確 包括剪接共有序列突變、錯義突變和整碼突變。

4.4 報道與臨床表型相關聯(lián)但致病性不明確 即通過全基因組關聯(lián)分析(GWAS)得到的與復雜疾病易感性相關的變異。

4.5 其他 不滿足上述4類的變異，如：尚不認為能導致疾病的新變異，新發(fā)的同義突變；已報道為中性突變的變異；在公共數(shù)據(jù)庫中有一定突變頻率的罕見變異，這類罕見變異部分可構成常染色體隱性遺傳模式而致病。

5 結合遺傳模式和臨床綜合判斷

針對候選致病突變，應當進一步具體結合相關疾病的遺傳模式以及患者實際的臨床表型進行綜合判斷。

就單基因病的常染色體遺傳模式而言，如果疾病為常染色體顯性遺傳模式，則其致病基因一般僅發(fā)生單個位點的嚴重突變，且該突變在正常人群中極有可能為新發(fā)突變。如果疾病為常染色體隱性遺傳模式，則其致病基因上將發(fā)生至少2個嚴重突變。符合這種遺傳模式的突變，可在正常人群中有一定的突變頻率，但一般情況下不會出現(xiàn)純合子[2]。若在致病基因上發(fā)生的突變不符合相關疾病的遺傳模式(如疾病為常染色體隱性遺傳模式，但在該疾病相關基因上僅發(fā)生單位點雜合突變)，該突變位點應當被滯后考慮[38]。

對于患者的潛在致病突變，須將其臨床表型與突變基因對應的表型譜進行比對。收集諸如患者病歷、家族史等信息，將有助于明確患者的致病成因[1]。

[1]Bao R, Huang L, Andrade J, et al. Review of current methods, applications, and data management for the bioinformatics analysis of whole exome sequencing. Cancer Inform, 2014, 13(Suppl 2):67-82

[2]Yang Y, Muzny DM, Reid JG, et al. Clinical whole-exome sequencing for the diagnosis of mendelian disorders. N Engl J Med, 2013, 369(16):1502-1511

[3]Lee H, Deignan JL, Dorrani N, et al. Clinical exome sequencing for genetic identification of rare Mendelian disorders. JAMA, 2014, 312(18):1880-1887

[4]Dewey FE, Grove ME, Pan C, et al. Clinical interpretation and implications of whole-genome sequencing. JAMA, 2014, 311(10):1035-1045

[5]Berg JS. Genome-scale sequencing in clinical care: establishing molecular diagnoses and measuring value. JAMA, 2014, 312(18):1865-1867

[6]Need AC, Shashi V, Hitomi Y, et al. Clinical application of exome sequencing in undiagnosed genetic conditions. J Med Genet, 2012, 49(6):353-361

[7]Yang Y, Muzny DM, Xia F, et al. Molecular findings among patients referred for clinical whole-exome sequencing. JAMA, 2014, 312(18):1870-1879

[8]Eng CM, Yang Y, Plon SE. Genetic diagnosis through whole-exome sequencing. N Engl J Med, 2014, 370(11):1068

[9]Wu L, Schaid DJ, Sicotte H, et al. Case-only exome sequencing and complex disease susceptibility gene discovery: study design considerations. J Med Genet, 2015, 52(1):10-16

[10]Li H, Handsaker B, Wysoker A, et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics, 2009, 25(16):2078-2079

[11]McKenna A, Hanna M, Banks E, et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res, 2010, 20(9):1297-1303

[12]Van der Auwera GA, Carneiro MO, Hartl C, et al. From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline. Curr Protoc Bioinformatics, 2013, 11(1110):11.10.1-11.10.33

[13]Wang K, Li M, Hakonarson H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Res, 2010, 38(16):e164

[14]McLaren W, Pritchard B, Rios D, et al. Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor. Bioinformatics, 2010, 26(16):2069-2070

[15]Maglott DR, Katz KS, Sicotte H, et al. NCBI′s LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Res, 2000, 28(1):126-128

[16]Stenson PD, Ball EV, Mort M, et al. Human Gene Mutation Database (HGMD): 2003 update. Hum Mutat, 2003, 21(6):577-581

[17]Stenson PD, Mort M, Ball EV, et al. The Human Gene Mutation Database: building a comprehensive mutation repository for clinical and molecular genetics, diagnostic testing and personalized genomic medicine. Hum Genet, 2014, 133(1):1-9

[18]Schorderet DF. Using OMIM (On-line Mendelian Inheritance in Man) as an expert system in medical genetics. Am J Med Genet, 1991, 39(3):278-284

[19]Zhuang YL(莊永龍), Zhou M, Li YD, et al. The Application of Human Mutation Databases. Hereditas(Beijing)(遺傳), 2004, 26(4):514-518

[20]Amberger JS, Bocchini CA, Schiettecatte F, et al. OMIM.org: Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM(R)), an online catalog of human genes and genetic disorders. Nucleic Acids Res, 2015, 43(Database issue):789-798

[21]Landrum MJ, Lee JM, Riley GR, et al. ClinVar: public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Res, 2014, 42(Database issue):980-985

[22]1000 Genomes Project Consortium, Abecasis GR, Altshuler D, Auton A, et al.A map of human genome variation from population-scale sequencing.Nature, 2010,467(7319):1061-1073

[23]1000 Genomes Project Consortium, Abecasis GR, Altshuler D, et al. A map of human genome variation from population-scale sequencing. Nature, 2010, 467(7319):1061-1073

[24]http://macarthurlab.org/2014/11/18/a-guide-to-the-exome-aggregation-consortium-exac-data-set/

[25]Sim NL, Kumar P, Hu J, et al. SIFT web server: predicting effects of amino acid substitutions on proteins. Nucleic Acids Res, 2012, 40(Web Server issue):452-457

[26]Ng PC, Henikoff S. Predicting deleterious amino acid substitutions. Genome Res, 2001, 11(5):863-874

[27]Ng PC, Henikoff S. Predicting the effects of amino acid substitutions on protein function. Annu Rev Genomics Hum Genet, 2006, 7:61-80

[28]Kumar P, Henikoff S, Ng PC. Predicting the effects of coding non-synonymous variants on protein function using the SIFT algorithm. Nat Protoc, 2009, 4(7):1073-1081

[29]Adzhubei IA, Schmidt S, Peshkin L, et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nat Methods, 2010, 7(4):248-249

[30]Schwarz JM, R?delsperger C, Schuelke M, et al. MutationTaster evaluates disease-causing potential of sequence alterations. Nat Methods, 2010, 7(8):575-576

[31]Sui WG(眭維國), Li LP, Che WT, et al. 人類遺傳疾病中常見變異和罕見變異的研究策略. Int J Lab Med(國際檢驗醫(yī)學雜志), 2011, 32(16):1847-1850

[32]Robinson PN, Krawitz P, Mundlos S. Strategies for exome and genome sequence data analysis in disease-gene discovery projects. Clin Genet, 2011, 80(2):127-132

[33]Richards CS, Bale S, Bellissimo DB, et al. ACMG recommendations for standards for interpretation and reporting of sequence variations: Revisions 2007. Genet Med, 2008, 10(4):294-300

[34]Ng SB, Bigham AW, Buckingham KJ, et al. Exome sequencing identifies MLL2 mutations as a cause of Kabuki syndrome. Nat Genet, 2010, 42(9):790-793

[35]Robinson PN, K?hler S, Oellrich A, et al. Improved exome prioritization of disease genes through cross-species phenotype comparison. Genome Res, 2014, 24(2):340-348

[36]Pippucci T, Parmeggiani A, Palombo F, et al. A novel null homozygous mutation confirms CACNA2D2 as a gene mutated in epileptic encephalopathy. PLoS One, 2013, 8(12):e82154

[37]Smedley D, K?hler S, Czeschik JC, et al. Walking the interactome for candidate prioritization in exome sequencing studies of Mendelian diseases. Bioinformatics, 2014, 30(22):3215-3222

[38]Zemojtel T, K?hler S, Mackenroth L, et al. Effective diagnosis of genetic disease by computational phenotype analysis of the disease-associated genome. Sci Transl Med, 2014, 6(252):252ra123

(本文編輯：張崇凡)

首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院2015年國家級繼續(xù)醫(yī)學教育項目(一)

10.3969/j.issn.1673-5501.2015.01.003

上海市衛(wèi)生局重要疾病攻關項目:2013ZYJB0015；上海市科委/醫(yī)學領域重點項目子課題：14411950402,14DJ1400103；上海市衛(wèi)計委項目：滬衛(wèi)計科教〔2013〕018號

1 復旦大學生物統(tǒng)計學與計算生物學系 上海，200433；2 華中農業(yè)大學 武漢，430072；3 復旦大學附屬兒科醫(yī)院 上海，201102；4 上海市出生缺陷防治重點實驗室，復旦大學兒童發(fā)育與疾病轉化醫(yī)學研究中心，衛(wèi)生部新生兒疾病重點實驗室，復旦大學附屬兒科醫(yī)院 上海，201102

周文浩，E-mail：zwhchfu@126.com

2014-12-17

2015-01-20)