血小板衍生生長因子?C對體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞的影響

王子婧，錢智勇，郭希民，高德偉

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血小板衍生生長因子?C對體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞的影響

王子婧，錢智勇，郭希民，高德偉*

（解放軍總醫(yī)院南樓臨床部綜合外二科，北京 100853）

觀察血小板衍生生長因子?C（PDGF-C）對體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞（VECs）及間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的影響。采用培養(yǎng)的大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞和MSCs，應(yīng)用細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法、噻唑藍(lán)比色法（MTT法）評價(jià)細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，利用Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞遷移能力。PDGF-C能明顯刺激VECs和MSCs的增殖，增加兩種細(xì)胞S期細(xì)胞的比例，對VECs增殖呈劑量依賴關(guān)系，對MSCs的促增殖作用在20μg/L達(dá)高峰。同時(shí)，PDGF-C促進(jìn)VECs和MSCs的遷移能力，對MSCs遷移作用強(qiáng)于VECs。PDGF-C可促進(jìn)培養(yǎng)的VECs、MSCs的增殖與遷移能力。

大鼠；血小板衍生生長因子C；血管內(nèi)皮細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞增殖；遷移

血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cells，VECs）是血管內(nèi)循環(huán)血液與中層平滑肌細(xì)胞之間的機(jī)械屏障，維持機(jī)體重要的生理功能。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后脫落，膠原及組織因子暴露，是形成動靜脈血栓的重要始動因素。因此，血管內(nèi)皮損傷后修復(fù)可作為血栓性疾病治療的方法之一。其修復(fù)原理主要包括兩方面：一是增強(qiáng)成熟內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化能力，加速內(nèi)皮的自身修復(fù)；二是動員間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）歸巢到損傷部位，內(nèi)皮化后替代修復(fù)[1]。血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）是正常組織生長和維持的重要生長因子，包括至少PDGF-A，B，C，D 4個(gè)成員，其中PDGF-A和B的研究已較成熟，而PDGF-C則是新發(fā)現(xiàn)成員之一。研究表明PDGF-C有較強(qiáng)的促進(jìn)血管新生能力[2.3]，其所具有的多重生物學(xué)效應(yīng)是血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）等其他生長因子所不具備的獨(dú)特功能[4]。且PDGF-C參與了動脈損傷后修復(fù)的過程，機(jī)制是促血管平滑肌細(xì)胞凋亡或干預(yù)血管平滑肌細(xì)胞遷移[5]，而對內(nèi)皮細(xì)胞和干細(xì)胞的作用尚沒有明確涉及。為此，我們利用PDGF-C對體外培養(yǎng)的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓MSCs進(jìn)行刺激，測定細(xì)胞增殖情況，評價(jià)細(xì)胞的遷移能力，從而了解PDGF-C對VECs及MSCs的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

PDGF-C（美國Peprotech公司）；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；胎牛血清（fatal bovine serum，F(xiàn)BS）；流式細(xì)胞周期檢測試劑盒、Hoechst33258染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；噻唑藍(lán)（美國Sigma公司）。

1.2 儀器

超凈工作臺（蘇州市凈化設(shè)備公司YJ-875）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Shell-Lab2323型）；倒置相差熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；流式細(xì)胞儀（美國Elite SP型）；酶標(biāo)分析儀（美國Bio-RAD Model 550型）、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國FJ-2003型）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

VECs的原代培養(yǎng)和體外增殖：過量1g/L戊巴比妥鈉注入SD大鼠（150g）的腹腔內(nèi)，麻醉致死，75%乙醇浸泡消毒3min后移入超凈臺，無菌條件下打開胸腔暴露胸主動脈，快速取胸主動脈。用眼科鑷夾除動脈外周的結(jié)締組織及脂肪，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗管腔內(nèi)面殘留血液。眼科剪剪開血管腔，將血管剪成2mm×2mm大小均勻的組織塊后轉(zhuǎn)移到25ml的培養(yǎng)瓶中，在含10% FBS的DMEM中培養(yǎng)，待內(nèi)皮細(xì)胞長成典型的鋪路石樣、細(xì)胞融合達(dá)到80%～90%，經(jīng)胰酶消化后傳代、取第5～8代細(xì)胞用作實(shí)驗(yàn)，因子Ⅷ免疫熒光鑒定VECs。將存有MSCs（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供）的凍存管從液氮中取出，37℃水浴復(fù)蘇，用含10% FBS的α-MEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖

分別取第5代對數(shù)生長期的VECs和MSCs，消化離心后計(jì)數(shù)，以2×104個(gè)/ml密度接種于96孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)24h后換用2%FBS繼續(xù)培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的PDGF-C（10，20，30，40，50μg/L），設(shè)對照組，加入等體積PBS。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h后加入MTT溶液（5g/L）20μl，繼續(xù)孵育4h后棄培養(yǎng)基，每孔加入150μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），吹勻后492nm波長處測吸光度值（492nm），以時(shí)間為橫軸，吸光度為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

取VECs和MSCs，常規(guī)培養(yǎng)24h，換含2%FBS的培養(yǎng)基及培養(yǎng)24h后，加入PDGF-C（20μg/L），對照組加入等量的PBS，再孵育24h后，胰酶消化3min，輕輕吹打呈細(xì)胞懸液，800r/min離心后，PBS漂洗3遍，重復(fù)離心，加入1ml PBS重懸細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度至1.5×106/ml，過300目細(xì)胞篩，去除團(tuán)聚細(xì)胞，加入-20℃預(yù)冷的70%乙醇溶液，4℃過夜。PBS充分漂洗離心后加入10μl RNA酶，37℃水浴30min，后加入25μl碘化丙啶染色，避光30min放于4℃冰箱，上樣前輕彈試管，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期（激發(fā)波長488nm）。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將兩種細(xì)胞以2×105/ml的密度接種在6孔培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)后，換用含2%FBS細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞融合達(dá)到80%后，用20μl無菌槍頭在每孔勻速縱向劃一道劃痕，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，加入含濃度為20μg/L的PDGF-C培養(yǎng)基，對照組加入等體積PBS。于0，6，12，24h進(jìn)行細(xì)胞拍照取材，觀察各組細(xì)胞向空白處遷移的情況。

1.7 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

用50mg/L Matrigel稀釋8倍后滴加于Transwell小室底部膜的下室面，在超凈臺內(nèi)風(fēng)干后備用。取第5代對數(shù)期細(xì)胞消化離心后，PBS洗1～2遍，用含10g/L牛血清白蛋白的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml。在Transwell小室內(nèi)加200μl細(xì)胞懸液，下室加入500μl含20μg/L PDGF-C的培養(yǎng)基，對照組加入等體積PBS。于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，用4%多聚甲醛液4℃固定15min，PBS充分清洗2遍，每次3min。分別加入Hoechst33258染色液，室溫靜置30min，充分染色后PBS清洗，熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照取材。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)及鑒定

原代培養(yǎng)VECs 4d時(shí)，顯微鏡下可見有少量的細(xì)胞遷出貼壁生長，細(xì)胞呈短梭形或多角形。培養(yǎng)至12d，細(xì)胞貼壁生長達(dá)到培養(yǎng)瓶面積＞2/3，呈現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞典型的“鋪路石”樣特征。取第4代生長良好的VECs，經(jīng)因子Ⅷ抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色鑒定，呈陽性表現(xiàn)；復(fù)蘇后的MSCs融合單層，細(xì)胞形態(tài)大多呈長梭形或多角形，符合MSCs的細(xì)胞形態(tài)（圖1）。

2.2 PDGF-C對細(xì)胞增殖的影響

觀察不同濃度下PDGF-C對VECs和MSCs增殖的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，加入PDGF-C的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。加入PDGF-C后，兩種細(xì)胞均在第4天增殖達(dá)高峰。隨著PDGF-C濃度的增加，VECs的增殖能力逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)出一種濃度效應(yīng)關(guān)系（圖2）；而MSCs的增殖在PDGF-C為20μg/L濃度時(shí)達(dá)高峰（＜0.01；圖3），當(dāng)濃度繼續(xù)增加時(shí)，MSCs的增殖能力不再繼續(xù)增強(qiáng)。

圖1 血管內(nèi)皮細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

Figure 1 Cultivation and identification of VECs and MSCs

VECs: vascular endothelial cells; MSCs: mesenchymal stem cells; A: primary VECs (×100); B: cultured MSCs (×100); C: VECs Dapi nuclear staining (×400); D: positive expression of factor Ⅷ in VECs (×400)

2.3 PDGF-C對細(xì)胞周期的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過PDGF-C的刺激，VECs及MSCs細(xì)胞周期各時(shí)相的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比與對照組相比有明顯不同。其中，MSCs細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞比例明顯降低（＜0.05），S期細(xì)胞比例與對照組相比顯著增加（＜0.05），G2＋M期細(xì)胞比例變化不大（＞0.05；圖4）。

PDGF-C同樣增加了VECs增殖期S期細(xì)胞比例（＜0.05），G1期細(xì)胞比例明顯降低（＜0.05），G2＋M期細(xì)胞比例有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05；圖5）。

圖2 PDGF-C在不同濃度時(shí)對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響

Figure 2 Effects of PDGF-C in different concentrations on VECs proliferation

PDGF-C: platelet-derived growth factor-C; VECs: vascular endothelial cells. PDGF-C promotes VECs proliferation in a dose-dependent manner. Compared with control group,*<0.05,**<0.01

圖3 PDGF-C在不同濃度時(shí)對間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的影響

Figure 3 Effects of PDGF-C in different concentrations on MSCs proliferation

PDGF-C: platelet-derived growth factor-C; MSCs: mesenchymal stem cells. PDGF-C promotes MSCs proliferation, and MSCs proliferation reaches peak at 20μg/L concentration of PDGF-C. Compared with control group,*＜0.05,**＜0.01

圖4 PDGF-C對間充質(zhì)干細(xì)胞周期的影響

Figure 4 Effects of PDGF-C on MSCs phases

PDGF-C: platelet-derived growth factor-C; MSCs: mesenchymal stem cells. Compared with control MSCs,*＜0.05

圖5 PDGF-C對血管內(nèi)皮細(xì)胞周期的影響

Figure 5 Effects of PDGF-C on VECs phases

PDGF-C: platelet-derived growth factor-C; VECs: vascular endothelial cells. Compared with control VECs,*＜0.05

2.4 細(xì)胞遷移的劃痕實(shí)驗(yàn)檢測

結(jié)果顯示，劃痕后，加入PDGF-C后的MSCs向空白處遷移的細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組（圖6）；VECs向空白處遷移的細(xì)胞有所增加，但遷移能力的增強(qiáng)不如MSCs明顯（圖7）。

2.5 細(xì)胞遷移能力Transwell實(shí)驗(yàn)檢測

培養(yǎng)24h后，可見VECs及MSCs遷移到小室底部膜的下室面，細(xì)胞遷出后，形態(tài)呈細(xì)長型。加入PDGF-C后，小室膜下室面VECs及MSCs數(shù)量都有增加，且對MSCs的遷移能力影響更大（圖8）。

3 討 論

內(nèi)皮細(xì)胞完整性的破壞是導(dǎo)致多種血管性疾病的重要原因，最常見的疾病就是動靜脈血栓的形成。因此，保護(hù)并維持血管內(nèi)膜完整性、減輕內(nèi)皮損傷及加快內(nèi)皮損傷修復(fù)是防治血管性疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。PDGF家族是維持組織正常生長的重要生長因子，PDGF-C是該家族成員之一，在多種正常組織多個(gè)階段都有表達(dá)，參與生物體的生長發(fā)育。在成熟的組織中，PDGF-C主要表達(dá)于腎、睪丸、肝、心及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等[6]。在脈管系統(tǒng)中，PDGF-C主要表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞[7]。PDGF-C通過結(jié)合并活化PDGF受體a（PDGFR-a），使信號傳遞進(jìn)入細(xì)胞[6]，而其活化形式PDGF-CC不僅可和PDGFR-a的同型二聚體PDGFR-aa具有很高親和力，同時(shí)也可與PDGF-a/β異二聚體相結(jié)合[3,8]，通過激活特異酪氨酸蛋白激酶，能促進(jìn)細(xì)胞DNA合成和分裂增殖[8]。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明PDGF-C有較強(qiáng)的促進(jìn)血管新生能力[2,3]。有研究顯示，灌注PDGF-C可促進(jìn)缺血心臟的血供重建及誘導(dǎo)缺血肢體的血管新生，這些多重生物學(xué)效應(yīng)是VEGF和bFGF等其他生長因子所不具備的獨(dú)特功能[4]。Banfi等[10]研究顯示PDGF-C能引起VEGF蛋白水平的上調(diào)，通過使VEGF蛋白水平上調(diào)使血管局部VEGF濃度增高，動員更多內(nèi)皮祖細(xì)胞到達(dá)損傷部位，修復(fù)損傷的內(nèi)皮及促進(jìn)血管的新生[11]。

圖6 間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞遷移能力劃痕實(shí)驗(yàn)

Figure 6 Cell scratch test for detection of MSCs migration (×100)

PDGF-C: platelet-derived growth factor-C; MSCs: mesenchymal stem cells. A: control MSCs; B: PDGF-C treated MSCs

圖7 血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞遷移能力劃痕實(shí)驗(yàn)

Figure 7 Cell scratch test for detection of VECs migration (×100)

PDGF-C: platelet-derived growth factor-C; VECs: vascular endothelial cells. A: control VECs; B: PDGF-C treated VECs

圖8 血管內(nèi)皮細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞transwell遷移實(shí)驗(yàn)

Figure 8 Transwell assay for detection of VECs and MSCs migration at 24h (×100)

PDGF-C: platelet-derived growth factor-C; VECs: vascular endothelial cells; MSCs: mesenchymal stem cells. A: control VECs; B: PDGF-C treated VECs; C: control MSCs; D: PDGF-C treated MSCs

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)PDGF-C能明顯促進(jìn)VECs和MSCs的增殖。流式細(xì)胞周期也證實(shí)了PDGF-C能刺激停滯于G0/G1期的細(xì)胞進(jìn)入分裂增殖周期，S期細(xì)胞比例增大，說明處于活躍的DNA復(fù)制與合成期的細(xì)胞量有所增加，這也證實(shí)了PDGF-C能促進(jìn)VECs及MSCs內(nèi)DNA的合成，加快有絲分裂及增殖。

PDGF-C在組織的損傷修復(fù)中不僅表現(xiàn)其絲裂原活性，同時(shí)能增加細(xì)胞的遷移能力。研究表明PDGF-C可促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的上調(diào)[12]，MMPs通過其酶解能力，減少細(xì)胞外基質(zhì)，從而促使細(xì)胞遷移[13]，而MMP-2和MMP-9均可刺激局部組織血管的新生[14]。在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，觀察到20μg/L的PDGF-C能明顯促進(jìn)VECs及MSCs的遷移，而其對MSCs促進(jìn)作用更為明顯。

綜上所述，PDGF-C不但能增強(qiáng)VECs及MSCs的增殖能力，同時(shí)也能促進(jìn)其遷移。以上生物學(xué)作用可在血管損傷性疾病的防治中提供新思路，不但有效地增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖修復(fù)，也可促進(jìn)干細(xì)胞在體內(nèi)的歸巢與遷移，共同促進(jìn)內(nèi)皮損傷后的修復(fù)。

[1] Hristov M, Erl W, Weber PC. Endothelial progenitor cells: mobilization, differentiation, and homing[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2003, 23(7): 1185?1189.

[2] Li X, Tjwa M, Moons L,Revascularization of ischemic tissues by PDGF-CCeffects on endothelial cells and their progenitors[J]. J Clin Invest, 2005, 115(1): 118?127.

[3] Cao R, Brokenhielm E, Li X,. Angiogenesis stimulated by PDGF-CC, a novel member in the PDGF family, involves activation of PDGFR-alphaalpha and-alphabeta receptors[J]. FASEB J, 2002, 16(12): 1575?1583.

[4] Leistner DM, Fischer-Rasokat U, Honold J,. Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCARE-AMI): final 5-year results suggest long-term safety and efficacy[J]. Clin Res Cardiol, 2011, 100(10): 925?934.

[5] Ostan A, Heldin CH. Involvement of platelet-derived growth factor in disease: development of specific antagonists[J]. Adv Cancer Res, 2001, 80: 1?38.

[6] Aase K, Abramsson A, Karlsson L,. Expression analysis of PDGF-C in adult and developing mouse tissues[J]. Mech Dev, 2002, 110 (1?2): 187?191.

[7] Uutela M, Lauren J, Bergsten E,. Chromosomal location, exon structure, and vascular expression patterns of the human PDGF-C and PDGF-D genes[J]. Circulation, 2001, 103(18): 2242?2247.

[8] Gilbertson DG, Duff ME, West JW,. Platelet-derived growth factor C(PDGF-C), a novel growth factor that binds to PDGF alpha and beta receptor[J]. J Biol Chem, 2001, 276(29): 27406?27414.

[9] Marmur ID, Poon M, Rossikina M,. Induction of PDGF-responsive genes in vascular smooth muscle. Implications for the early response to vessel injury[J]. Circulation, 1992, 86(Suppl 6):Ⅲ53?60.

[10] Banfi A, von Degenfeld G, Gianni-Barrera R,. Therapeutic angiogenesis due to balanced single-vector delivery of VEGF and PDGF-BB[J]. FASEB J, 2012, 26(6): 2486?2497.

[11] Jiang K, Li CY, Meng QY,. Transplantation of endothelial progenitor cells in the treatment of chronic deep venous thrombosis[J]. Chin J Gen Surg, 2010, 25(1): 61?63. [姜 坤, 李傳勇, 孟慶友, 等. 內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療慢性深靜脈血栓形成的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國普通外科學(xué)雜志, 2010, 25(1): 61?63.]

[12] Wagsater D, Zhu C, Bjorck HM,. Effects of PDGF-C and PDGF-D on monocyte migration and MMP-2 and MMP-9 expression[J]. Atherosclerosis, 2009, 202(2): 415?423.

[13] Inkinen K, Turakainen H, Wolff H,. Expression and activity of matrix metalloproteinase-2 and -9 in experimental granulation tissue[J]. APMIS, 2000, 108(5): 318?328.

[14] Collen A, Hanemaaijer R, Lupu F,. Membrane-type matrix metalloproteinase-mediated angiogenesis in a fibrin-collagen matrix[J]. Blood, 2003, 101(5): 1810?1817.

（編輯: 周宇紅）

Platelet-derived growth factor-C promotes proliferation and migration of vessel endothelial cells and mesenchymal stem cells

WANG Zi-Jing, QIAN Zhi-Yong, GUO Xi-Min, GAO De-Wei*

(Second Department of Geriatric Comprehensive Surgery, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

To determine the effect of platelet-derived growth factor-C (PDGF-C) on vascular endothelial cells (VECs) and mesenchymal stem cells(MSCs) culturedo.The VECs were isolated from thoracic aorta of SD rats and then cultured. Cryopreserved MSCs were cultured after water bath at 37℃. Cell counting and MTT assay were used to detect the effect of PDGF-C (0, 10, 20, 30, 40 and 50μg/L) on cell proliferation. Flow cytometry was used to detect cell phases. Transwell assay and cell scratch test were used to detect cell migration.PDGF-C significantly promoted the proliferation of VECs and MSCs, and increased the percentage of the cells arrested at S phase. Its effect on the VECs proliferation was found in a dose-dependent manner. PDGF-C of 20μg/L promoted the MSCs proliferation at a summit. PDGF-C also promoted the migration ability of cultured VECs and MSCs, especially on MSCs.PDGF-C promotes the proliferation and migration of cultured VECs and MSCs.

rats; platelet-derived growth factor-C; vascular endothelial cells; mesenchymal stem cells; cell proliferation; migration

R329.2+8

A

10.11915/j.issn.1671-5403.2015.08.142

2015?04?15;

2015?05?07

高德偉, E-mail: gaodw301@sina.com