銀杏內(nèi)酯B對視神經(jīng)鉗夾傷后大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的保護作用*

鄭幼平 吳小桃 田原 張曉明 周小娟 孟晶

青光眼是世界第二位致盲性眼病，是一種威脅視神經(jīng)視覺功能的眼病，具體發(fā)病機制尚不清楚。一般認為視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinal ganglion cells，RGCs）是以細胞凋亡的形式減少，尋找有效藥物減輕或延遲視神經(jīng)損害，是研究視神經(jīng)損傷的一個主要方面[1-3]。銀杏內(nèi)酯B（ginkgolide B，GB）是銀杏葉提取物中主要的活性成分。前期研究證實GB能夠上調(diào)Bcl-2/Bax比值，從而降低細胞內(nèi)Ca2+濃度，實現(xiàn)保護體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞作用，并對N-甲基-N-亞硝脲（N-methyl-N-nitrosourea，MNU）誘導(dǎo)的實驗性大鼠視網(wǎng)膜變性所致的視網(wǎng)膜光感受器細胞損傷和視功能損害具有抑制作用[4-6]。為進一步探討銀杏內(nèi)酯B對大鼠視神經(jīng)鉗夾傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGCs）的保護作用進行了本研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取出生46 d的SD大鼠（中山大學(xué)實驗動物中心提供）36只，雌雄不拘。全部飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)鼠籠中，維持12 h白晝，12 h夜晚時間周期。

1.2 視神經(jīng)鉗夾傷建模方法 以1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，按Nakazawa等[7]的方法暴露視神經(jīng)；剪開外眥角，沿角膜緣外1 mm剪開球結(jié)膜，向后鈍性分離暴露視神經(jīng)。用頭部寬1 mm，長18 mm的微血管止血鉗（上海醫(yī)療器械有限公司）夾持10 s，直接檢眼鏡觀察視網(wǎng)膜，視網(wǎng)膜無缺血性改變者為成功模型；縫合球結(jié)膜和外眥角，涂金霉素眼膏。術(shù)中注意盡可能鈍性分離球后筋膜組織并避開血管，減少對眼球血液供應(yīng)的影響，同時注意原位操作，盡可能減少對視神經(jīng)的牽拉。

1.3 處理方法 A組（正常對照組）不經(jīng)任何處理；B組（模型組）、C組（GB治療組）大鼠暴露并鉗夾視神經(jīng)；B組實驗前1周每日腹腔注射NS，容積參照GB的劑量（40 mg/kg），造模后繼續(xù)腹腔注射NS直至處死。C組實驗前1周腹腔注射GB 40 mg/kg（廣州市藥檢所提供），于造模后繼續(xù)腹腔注射1周直至處死。三組分別在術(shù)后1周，F(xiàn)-VEP檢查后隨機處死大鼠行HE染色光鏡檢查，每組各4只，其余2周后作RGCs計數(shù)。

1.4 閃光視覺誘發(fā)電位（F-VEP）每組隨機抽取8只大鼠，采用BIO-2000型視覺電生理檢查系統(tǒng)（重慶貝澳電子儀器有限公司）檢查閃光視覺誘發(fā)電位（flash visual evoked potentials，F(xiàn)-VEP）。檢查時關(guān)閉照明，暗適應(yīng)10 min后，進行雙眼F-VEP采集。背景參數(shù)：Ganzfeld閃光刺激器，光強為10 db，刺激頻率為1.9 Hz單閃刺激模式，波形疊加80次，閾值設(shè)定為50 mV。主要觀察AP1（N1-P1振幅）和LP1（P1波潛伏期），振幅的大小以微伏（μV）為單位，潛伏期以毫秒（ms）為單位，Nl谷底至Pl頂峰為Nl-Pl的振幅值（AP1），起始至P1頂峰的時間為P1峰潛伏期（LP1）。實驗數(shù)據(jù)為3次測量的平均值。

1.5 組織切片制作及RGCs計數(shù) 三組分別在造模后1周，F(xiàn)-VEP檢查后隨機處死大鼠，A、B、C組各4只。造模后2周，處死所有大鼠。在角膜緣12：00位縫線作標(biāo)記并摘取眼球。立體解剖顯微鏡下去除眼前節(jié)和晶狀體后放入4%多聚甲醛溶液中固定過夜，沿縱軸將眼球兩邊開窗，組織脫水后行石蠟包埋，選取包含視神經(jīng)的縱切面，沿12：00-6：00經(jīng)線并沿視神經(jīng)中央對剖開眼球，連續(xù)切片（切片厚度4 μm），行蘇木精-伊紅（HE）染色。400倍放大倍率的視野顯微鏡下，從12：00-6：00鋸齒緣（經(jīng)視盤中央），計數(shù)整個經(jīng)線上的RGCs，取其平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 利用統(tǒng)計學(xué)軟件SAS 6.12對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料采用（x-±s）表示，多組間比較行方差分析，兩兩比較行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果 A組HE：神經(jīng)纖維層較厚，RGCs呈立方形，排列緊密，胞漿豐富，胞核飽滿且染色較均勻，神經(jīng)膠質(zhì)細胞較少（圖1、2）；B組HE：神經(jīng)纖維層極薄，RGCs稀少，同時神經(jīng)膠質(zhì)細胞明顯增多（圖3、4）；C組HE：RGCs胞體大小正常，數(shù)目較正常略少，視神經(jīng)損傷后2周，神經(jīng)纖維層輕度變?。▓D5、6）。

2.2 三組RGCs數(shù)的比較 視神經(jīng)損傷2周，垂直經(jīng)線上RGCs計數(shù)結(jié)果為A組（281±39）個，B組（112±20）個，C組（228±35）個，A、B、C三組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 A組視神經(jīng)損傷后1周的大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)（HE×400）

圖4 B組視神經(jīng)損傷后2周的大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)（HE×400）

圖2 A組視神經(jīng)損傷后2周的大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)（HE×400）

圖5 C組視神經(jīng)損傷后1周的大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)（HE×400）

圖3 B組視神經(jīng)損傷后1周的大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)（HE×400）

圖6 C組視神經(jīng)損傷后2周的大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)（HE×400）

2.3 三組視神經(jīng)損傷后1周和2周時的F-VEP比較 視神經(jīng)損傷后1周，B組較A、C組LPl波延長、AP1降低（P<0.05），C組與A組LP1、AP1比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。視神經(jīng)損傷后2周，B組的LPl較前1周進一步延長，AP1進一步降低，A、B、C三組LPl、AP1比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1、圖7。

表1 三組視神經(jīng)損傷后1周和2周時的閃光視覺誘發(fā)電位（±s）

表1 三組視神經(jīng)損傷后1周和2周時的閃光視覺誘發(fā)電位（±s）

*與A組比較，P<0.05；△與B組比較，P<0.05

視神經(jīng)損傷后2 周組別 視神經(jīng)損傷后1 周AP1（μV）LP1（ms）AP1（μV）LP1（ms）A 組（n=8）19±3 90±4 21±3 92±11 B 組（n=8）11±3* 110±6* 7±2* 186±15*C組（n=8）18±2△ 94±4△ 14±3*△ 104±12*△F值 20.73 23.17 53.45 128.19 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖7 視神經(jīng)損傷后1周和2周時的F-VEP注：左側(cè)為損傷后1周，右側(cè)為損傷后2周；上、中、下依次為A、B、C組

3 討論

視神經(jīng)鉗夾傷后，RGCs經(jīng)歷機械性損傷的快速死亡階段，剩余存活RGCs發(fā)生類似于青光眼視神經(jīng)病變的慢性損傷過程[8-9]。Dezawa等[10]研究認為視神經(jīng)損傷后RGCs退化的快與慢，存活時間的長與短，和RGCs軸突的再生潛力有直接的關(guān)系，存活時間越長，其再生潛力越大。視神經(jīng)損傷后，若能夠采取積極有效的治療措施減少和延緩RGCs在細胞快速喪失期的退變，就可能會明顯提高視神經(jīng)功能的恢復(fù)[11-12]。

術(shù)后1周和術(shù)后2周的大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色切片，光學(xué)顯微鏡下觀察可見：正常對照組神經(jīng)纖維層較厚，RGCs呈立方形，排列緊密，胞漿豐富，胞核飽滿且染色較均勻，神經(jīng)膠質(zhì)細胞較少；模型組神經(jīng)纖維層變得極薄，RGCs胞體減小，數(shù)目稀少，同時神經(jīng)膠質(zhì)細胞明顯增多；GB治療組術(shù)后1周，神經(jīng)纖維層厚度基本正常，RGCs胞體大小正常，數(shù)目較正常略少，術(shù)后2周，神經(jīng)纖維層輕度變薄。模型組視神經(jīng)鉗夾傷后，RGCs形態(tài)和數(shù)量均明顯受損。而GB治療組與模型組比較，RGCs胞體大小正常，數(shù)目僅輕度減少。應(yīng)用術(shù)后2周的大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色切片，400倍的光學(xué)顯微鏡下直接計數(shù)各組大鼠視網(wǎng)膜整個垂直經(jīng)線上（12：00-6：00）經(jīng)視盤中央的RGCs數(shù)目：正常對照組（281±39）個，模型組（112±20）個，GB治療組（228±35）個。模型組RGCs數(shù)目較正常組明顯減少，而GB治療組RGCs數(shù)目明顯優(yōu)于模型組。以上研究結(jié)果初步證明GB能改善視神經(jīng)鉗夾傷后RGCs存活數(shù)量和時間。

F-VEP是以閃光刺激視網(wǎng)膜在大腦枕葉皮層而誘發(fā)的一組電信號，反映視覺信息在視路中傳導(dǎo)的總體情況，是客觀評價視功能的重要參考指標(biāo)[13]。主要觀察指標(biāo)為主波的潛伏期及幅值，潛伏期的長短反應(yīng)髓鞘的器質(zhì)完整性和功能狀態(tài)，振幅的高低反應(yīng)軸索的功能狀態(tài)[14]。正常視神經(jīng)纖維在篩板后有髓鞘，其神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)為跳躍式；視神經(jīng)損傷時，髓鞘變性脫落，潛伏期延遲且振幅降低[15]。

本研究F-VEP的測定中采用全視野單閃刺激模式，刺激的強度和頻率易于控制。結(jié)果顯示，視神經(jīng)損傷后1周，A、B、C三組的Pl波的潛伏期和振幅分別 為 [（90±4）ms，（19±3）μV]、[（110±6）ms，（11±3）μV]和 [（94±4）ms，（18±2）μV]； 視 神經(jīng)損傷后2周，A、B、C三組的Pl波的潛伏期和振幅分別 為 [（92±11）ms，（21±3）μV]、[（186±15）ms，（7±2）μV] 和 [（104±12）ms，（14±3）μV]。證明GB能有效緩解視神經(jīng)鉗夾傷后引起的大鼠視功能的損傷。F-VEP結(jié)果與各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)改變相符合，說明腹腔注射銀杏內(nèi)酯B能部分抑制大鼠視神經(jīng)鉗夾后RGCs凋亡，具有一定的RGCs保護作用，并能部分緩解視功能的損傷。有關(guān)GB對RGCs功能的保護作用及機制將進一步深入研究。

[1] Weinmann S，Ron S，Schwarzbach C.Effects of Ginkgo biloba in dementia：systematic review and meta-analysis[J].BMC Geriatrics，2010，3（17）：10-14.

[2] 官堂明，黃家園，黃潔浩，等.銀杏葉提取物防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床研究進展[J].中國老年醫(yī)學(xué)雜志，2012，11（32）：5078-5081.

[3] 朱翠萍.銀杏葉治療視網(wǎng)膜震蕩38例療效觀察[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2011，8（6）：61-62.

[4] 孟晶，唐仕波，林少芬，等.銀杏苦內(nèi)酯B 對體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞凋亡的影響[J].中國病理生理雜志，2006，22（2）：791-795.

[5] 孟晶，唐仕波，林少芬，等.銀杏內(nèi)酯B對N-甲基-N-亞硝脲誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜變性的保護作用[J].眼科研究，2006，24（4）：340-343.

[6] 孟晶，丁小燕，朱曉波，等.銀杏苦內(nèi)酯B 對體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子濃度和線粒體功能的影響[J].中國病理生理雜志，2009，25（11）：2192-2196.

[7] Nakazawa T，Tamai M，Mori N.Brain-derived neurotrophic factor prevents axotomized retinal ganglion cell death through MAPK and PI3K signaling pathways[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43（10）：3319-3326.

[8] Ma K，Xu L，Zhang H，et al.The effect of ginkgo biloba on the rat retinal ganglion cell survival in the optic nerve crush model[J].Acta Ophthalmol，2010，88（5）：553-557.

[9] Ma K，Xu L，Zhan H，et al.Dosage dependence of the effect of Ginkgo biloba on the rat retinal gangli on cell survival after optic nerve crush[J].Eye （Lond），2009，23（7）：1598-1604.

[10] Dezawa M，Kawana K，Negishi H，et al.Glial cells in degenersting and regeneranting optic nerve of the adult rat[J].Brain Res Bun，1999，48（6）：573-579.

[11] Cybulska-Heinrich A K，Mozaffarieh M，et al.Flammer Ginkgo biloba：an adjuvant therapy for progressive normal and high tension glaucoma[J].Mol Vis，2012，18（2）：390-402.

[12] Cheung Z H， Leung M C，Yip H K，et al.A neuroprotective herbal mixture inhibits caspase-3-independent apoptosis in retinal ganglion cells[J].Cell Mol Neurobiol，2008，28（1）：137-155.

[13] Yan H，Li F，Zhang L.A new and reliable animal model for optic nerve injury[J].Curr Eye Res，2012，37（10）：941-948.

[14] Huo Y，Yin X L，Ji S X，et al.Amino-Nogo inhibits optic nerve regeneration and functional recovery via the integrin αv signaling pathway in rats[J].Cell Physiol Biochem，2015，35（2）：616-626.

[15] Holmes M D，Sires S B.Flash visual evoked optic neuropathy[J].Ophthalmol Plast Reconstru Surg，2004，20（5）：342-346.