低溫對茶陵野生稻總基因組導入栽培稻后代耐冷性生理指標的影響

李*

（1湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，長沙410128；2株洲市農(nóng)業(yè)科學研究所，湖南株洲412007；3國家海洋局第一海洋研究所生態(tài)中心，山東青島266061）

低溫對茶陵野生稻總基因組導入栽培稻后代耐冷性生理指標的影響

李穎邦1，康敏2，宋偉3，程鵬1，洪亞輝1*

（1湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，長沙410128；2株洲市農(nóng)業(yè)科學研究所，湖南株洲412007；3國家海洋局第一海洋研究所生態(tài)中心，山東青島266061）

選用茶陵野生稻總基因組導入冷敏感品種R9810獲得的導入后代Km16為材料，以受體品種R9810為對照，在幼苗期低溫脅迫下，分別測定植株丙二醛、生長素、脫落酸含量以及SOD、CAT、POD活性。結果表明，導入后代Km16植株的丙二醛含量略低于R9810，而生長素、脫落酸含量則明顯高于R9810。同樣，Km16植株的3種酶活性也產(chǎn)生了明顯的變化。

水稻；幼苗；耐冷性；生理指標

一般以抗氧化物酶活性、丙二醛含量以及植物激素含量變化作為指標來解釋作物存在抗寒性狀能力的原因以及受到冷傷害時作物有效應對的生理機制［1，2］。研究表明，植物細胞在遭受到低溫脅迫時，細胞內(nèi)的活性氧類物質（包括O-2、H2O2以及·OH等）的水平會顯著提高，從而造成細胞的損害［3］。一些抗氧化物酶，如：超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）都是有效保護細胞免受活性氧損害的保護酶類［4］。對低溫敏感的植物，其細胞抵御由低溫而產(chǎn)生的氧化損傷能力，很大程度上受到抗氧化類物質如SOD、POD、CAT等表達量的抑制［5］。丙二醛（MDA）是植物體組織器官衰老或者受到某些逆境脅迫下細胞發(fā)生膜脂過氧化形成的產(chǎn)物，MDA含量愈高，則細胞膜受到的損害程度就愈大［6］。許多研究以MDA含量的變化作為細胞脂質過氧化的判斷指標，用來表明細胞膜的脂質過氧化程度和對逆境脅迫的抵御情況［7］。脫落酸（ABA）和生長素（IAA）是兩種參與植物應答生物和非生物脅迫的重要激素［8～10］。已有研究指出，在逆境脅迫下植物體內(nèi)的ABA與鈣信號的轉導途徑存在相互調控機制，ABA含量的變化與鈣信號的出現(xiàn)和轉導有密切的聯(lián)系［11～13］。

野生稻具有抗低溫、抗旱、抗鹽堿等多種優(yōu)良的生物性狀，其基因資源已經(jīng)得到愈來愈多的研究人員的重視［14～16］。本研究以導入茶陵野生稻總基因組的后代Km16與其受體冷敏感品種R9810為對象，旨在比較其抗氧化物酶活性、MDA含量、植物激素的變化，以對水稻抗寒機理進行初步探析。

1 材料與方法

1.1茶陵野生稻總基因組導入受體水稻R9810

株洲市農(nóng)業(yè)科學研究所與湖南農(nóng)業(yè)大學細胞生物學研究室合作，通過花粉管通道法［17］將茶陵野生稻總基因組DNA導入冷敏感品種R9810，得到表型各異的導入后代。對導入后代進行RAPD多態(tài)性分析，并篩選出具有明顯耐寒能力的后代Km16。種子由湖南農(nóng)業(yè)大學細胞生物學研究室保存。

1.2水稻幼苗的栽培與處理

將Km16及R9810水稻種子以蒸餾水室溫浸泡2 d，種子出現(xiàn)破胸吐白后將其轉移到固體瓊脂培養(yǎng)基上繼續(xù)生長。約7 d后長成幼苗，將幼苗移植到含有蛭石的人工基質土并轉移到人工氣候箱中培養(yǎng)。溫度設定為30/25℃（光/暗），光照時間12 h，相對濕度70%。待水稻幼苗長至3葉期，將人工氣候箱溫度設置為4℃，光照和相對濕度不變，低溫處理12 h，每隔3 h取樣1次，剪取幼苗相同部位葉片進行各項指標測定。

1.3測定方法

MDA含量測定采用TBA顯色法［18］；SOD活性測定采用NBT光化還原法［19］；POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法［20］；CAT活性測定采用直接紫外分光光度法。植物激素樣品處理方法同文獻［21］，由湖南農(nóng)業(yè)大學植物激素研究室測定。

1.4統(tǒng)計分析

將數(shù)據(jù)匯總并進行正態(tài)分布檢驗，后進行單因素方差檢驗（one-way ANOVA）。在方差顯著水平小于0.05時（p＜0.05）進行鄧肯氏多重比較。所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 17.0軟件進行。

2 結果

2.1 MDA含量變化

如圖1所示，低溫脅迫后Km16與R9810植株MDA含量出現(xiàn)顯著上升（p＜0.05），并在3 h處都達到最大值，而后MDA的含量出現(xiàn)明顯的下降趨勢（p＜0.05），在9 h處達到最小值。初始及3 h取樣時，兩者MDA含量差異很小（p＞0.05），至6 h時，Km16的MDA含量明顯低于R9810（p＜0.05），而在之后的兩個取樣點，兩者差異較?。╬＞0.05）。存在不同的是，Km16的MDA含量在3 h處達到最大值后迅速下降，下降速率要比R9810快得多，表現(xiàn)出Km16的MDA含量對低溫脅迫比R9810更為敏感，反應也更為迅速。

圖1 低溫脅迫下Km16與R9810植株MDA含量變化

2.2三種酶活性變化

如圖2所示，Km16的SOD酶活力在低溫脅迫后的9 h之內(nèi)都呈現(xiàn)顯著的上升趨勢（p＜0.05），而低溫脅迫時間對R9810的SOD酶活性影響不顯著（p＞0.05）。在脅迫6 h與9 h時，Km16的SOD酶活性顯著高于R9810（p＜0.05），而在其他時間，兩者差異較小。

對POD酶活性的測定結果（圖3）表明，在受到低溫脅迫時，兩種材料植株內(nèi)的POD活性顯著低于其正常培養(yǎng)條件下的值（p＜0.05）。在大多數(shù)時間內(nèi)，Km16與R9810的POD酶活性差異不顯著，但在12 h處，Km16的POD酶活顯著高于R9810（p＜0.05）。

圖2 低溫脅迫下Km16與R9810植株SOD活性變化

圖3 低溫脅迫下Km16與R9810植株POD活性變化

CAT酶活力測定結果（圖4）表明，低溫脅迫下，Km16的酶活性在3 h處達到最大值，且在大部分時間內(nèi)顯著高于R9810（p＜0.05）。而在12 h處，兩者酶活性差異較小。

圖4 低溫脅迫下Km16與R9810植株中CAT活性變化

2.3 ABA與IAA含量變化

如圖5所示，Km16與R9810在常溫培養(yǎng)時其ABA含量差異很小。而在低溫脅迫下，Km16的 ABA含量明顯高于常溫培養(yǎng)時的值（p＜0.05），并在6 h時達到最大值。同時，在低溫脅迫下，Km16中的ABA含量明顯高于R9810（p＜0.05）。對于IAA而言（圖6），在低溫脅迫下其含量顯著低于常溫（p＜0.05），同時在大部分時間中，Km16的IAA含量顯著高于R9810（p＜0.05）。

圖5 低溫脅迫下Km16與R9810植株中ABA含量變化

圖6 低溫脅迫下Km16與R9810植株中IAA含量變化

3 小結與討論

MDA作為細胞脂質過氧化的判斷指標，已在水稻抗逆性研究中廣泛應用［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，在受到低溫脅迫的12 h之內(nèi)，水稻葉片的MDA含量呈現(xiàn)先升高再下降最后基本持平的趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，在低溫環(huán)境下，導入后代Km16與受體材料R9810相比較，雖然植株葉片中的總MDA含量相差較小，但Km16在6 h處首先出現(xiàn)了明顯的下降，這說明在受到低溫脅迫時，Km16能夠較快地降低MDA含量，比R9810更加積極地響應由于低溫造成的細胞脂質過氧化損傷。

SOD、POD以及CAT是生物體內(nèi)有效的自由基清除劑，在清除機體內(nèi)多余的超氧陰離子、解除超氧陰離子對生物體的毒性過程中起著關鍵性作用，并且能夠有效地維持細胞內(nèi)的活性氧代謝平衡，起到緩解活性氧毒性，保護細胞膜系統(tǒng)和其他生物大分子結構和功能的完整性［23］。通過測定導入后代Km16水稻植株的SOD活性表明，在低溫脅迫下其SOD活性明顯上升，且高于受體材料R9810的SOD酶活。Yong等［3］在對水稻進行抗冷能力馴化的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下水稻葉片中的SOD酶活性顯著升高，這一點與筆者的結果相一致。對CAT酶活性測定結果表明，在3 h處導入后代Km16的CAT酶活性顯著增高且高于受體材料R9810。然而通過對兩種實驗材料的POD酶活性測定后發(fā)現(xiàn)，低溫條件下其POD酶活性都出現(xiàn)了顯著下降。根據(jù)上述結果，筆者認為POD、SOD、CAT3種酶活處于動態(tài)平衡中，在低溫脅迫的12 h之內(nèi)，植株體優(yōu)先調整并升高了SOD的酶活來抵御低溫損傷，預計在12 h之后CAT和POD的酶活性將會升高。

ABA是植物抗逆脅迫時常涉及的生長激素，Km16在受到低溫脅迫后，ABA含量出現(xiàn)了明顯的增長，這可能是其在受到低溫脅迫后，通過提高ABA含量來調動鈣信號轉導，從而達到積極抵御低溫脅迫帶來的損害［11～13］。通過IAA含量的測定發(fā)現(xiàn)，兩組實驗材料的IAA含量都出現(xiàn)了下降，推測原因是IAA屬于促生長類激素，主要功能是影響植物體的生長發(fā)育，但在逆境條件下，植物體內(nèi)的IAA含量水平會有所降低，生長速率放緩，以應對不良的生存環(huán)境［24］。另外，導入后代Km16的IAA含量仍是高于R9810的，這可能表明在低溫條件下，Km16的生物活性高于R9810。

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Effects of Low Tem perature on Physiological Indexes of Cold Tolerance in Progeny of Cultivated Rice Be Transferred the Total Genom ic DNA of Chaling W ild Rice

LIYing-bang1，KANG M in2，SONG W ei3，CHEN Peng1，HONG Ya-hui1*
（1 College of Bio-science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2 Zhuzhou Agricultural Sciences Institute，Zhuzhou，Hunan 412007，China；3 Center for Ecology，the First Institute of Oceanography，SOA，Qingdao，Shandong 266061，China）

Km16，the progeny of cold-sensitive rice variety R9810 be transferred the total genomic DNA of Chaling wild rice，and controlmaterial R9810 were used to determined the contents ofMDA，IAA，ABA，and activities of SOD，CAT and POD at seedling stage under low temperature stress.The results indicated that the content of MDA was slightly lower in Km16 than that in R9810，while the contents of IAA and ABA in Km16 were significantly higher.Similarly，the activities of SOD，CAT and POD were obviously varied in Km16.

rice；seedling；cold tolerance；physiological indexes

S511.01

A

1001-5280（2015）01-0001-04 DOI：10.3969/j.issn.1001-5280.2015.01.01

2014-10-16

李穎邦（1990-），男，碩士研究生，Email：liyingbang2012@163.com。*通信作者：洪亞輝，教授，Email：161740991@qq.com。

農(nóng)業(yè)部948計劃項目（2013-Z58）；湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金項目（10K031）。