miR-21反義寡核苷酸增強地西他濱體外抗白血病效應*

王曄愷， 于 倩， 林奇龍， 姚燕珍， 梅佩玉， 李翊衛(wèi)

(舟山醫(yī)院檢驗中心， 浙江 舟山 316004)

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miR-21反義寡核苷酸增強地西他濱體外抗白血病效應*

王曄愷， 于 倩， 林奇龍， 姚燕珍， 梅佩玉， 李翊衛(wèi)△

(舟山醫(yī)院檢驗中心， 浙江 舟山 316004)

目的： 研究miR-21反義寡核苷酸(anti-miR-21 oligonucleotide， AMO)對地西他濱(decitabine,DCA)抗白血病效應的影響及可能機制。方法: 將AMO和無義寡核苷酸(scramble oligonucleotide, SCR)通過脂質體轉染導入HL-60細胞，實時熒光定量PCR(real-time PCR)驗證轉染效率，再分別與DCA 0.5、2.0和4.0 μmol/L作用48 h。Real-time PCR分別檢測人周期節(jié)律蛋白3(hPer3) mRNA表達，Annexin V/PI法檢測凋亡，流式細胞術檢測CD117和CD11b 平均熒光強度(MFI)。結果: AMO轉染組miR-21表達(0.35±0.07)低于空白組(0.71±0.07)和SCR轉染組(0.66±0.05)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。AMO轉染組的HL-60細胞DCA的IC50低于空白組和SCR轉染組(P<0.01)。同一濃度下，AMO組的早期凋亡率、CD11b的MFI和hPer3 mRNA均高于同一濃度藥物作用的空白組和SCR組，CD117 MFI均低于同一濃度藥物作用的空白組和SCR組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論: AMO能顯著促進DCA體外抗白血病效應，其機制可能與其協(xié)助激活hPer3的表達有關。

人周期節(jié)律蛋白3； HL-60細胞； 微小RNA-21； 地西他濱

地西他濱(decitabine,DCA)的主要成分5-氮雜-2’-脫氧胞苷酸，為目前已知最強的DNA甲基化特異性抑制劑，主要用于治療中高危骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes,MDS)，效果較佳，已超越傳統(tǒng)藥物。MDS是髓系中一組獲得性的、造血功能嚴重紊亂的造血干細胞的克隆性疾病，其特點為髓系中一系或多系血細胞發(fā)育異常和無效造血，常在數(shù)年后轉化為急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)。然而DCA用于治療AML遠不如MDS。微小RNA-21(microRNA-21，miR-21)在多種實體腫瘤[1-2]和部分系列的白血病[3]中呈高表達，應用miR-21反義寡核苷酸(anti-miR-21 oligonucleotide，AMO)在體外對肺癌等實體腫瘤細胞均存在抗腫瘤效益[4]。因此，本研究將AMO轉染進入AML HL-60細胞，觀察其對DCA的抗AML效益的影響。

材 料 和 方 法

1 反義寡核苷酸鏈設計

根據miRNA數(shù)據庫及參考其它文獻，設計AMO 5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’(22 bp)及隨機寡核苷酸(scrambled oligonucleotide,SCR)5’-CAGGAATCGGAACATCAAAGGT-3’(22 bp)，由上海朝瑞生物科技有限公司合成。

2 藥品、試劑和儀器

地西他濱粉劑購自Sigma；CD11b-PE、CD117-PE和FITC標記的膜聯(lián)蛋白-碘化丙啶(Annexin V/PI)凋亡試劑盒購自BD；RNA提取純化試劑盒購自Promega；Lipofectamine 2000轉染試劑盒和Trizol購自Invitrogen；miR-21擴增試劑盒購自ABI；One Step SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa；小牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)液購自Gibco。熒光PCR儀為ABI 7500;CO2培養(yǎng)箱為Jouan IG150;流式細胞儀為BD FACS Calibur，其中獲取軟件為CellQuest，分析軟件為FlowJo;冰凍離心機為Eppendorf 5714R。熒光定量PCR引物:hPer3上游引物為5’-ACAAACAGAACCACAAGGCA-3’,下游引物為5’-CGTCCATTTGTTGGCATTT-3’，擴增產物94 bp；GAPDH上游引物為5’-GACCTGACCTGCCGTCTA-3’，下游引物為5’-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’，擴增產物148 bp；均由上海生工生物工程公司合成。PCR儀購自Roche。

3 方法

3. 1 細胞培養(yǎng) AML細胞株HL-60購自中科院上海細胞庫。用含10%小牛血清、100 U·L-1青霉素和100 U·L-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞備用。配制密度為1×108/L的細胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL，置37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

3.2 AMO轉染及效率驗證、藥物處理 AMO和SCR均參照試劑盒說明書經Lipofectamine 2000試劑盒轉染到HL-60，并設立空白對照組，AMO和SCR濃度為2 μmol/L，轉染時間為6 h，細胞培養(yǎng)液為無血清RPMI 1640。

Trizol抽提轉染前后的HL-60細胞總RNA，采用紫外分光光度計測定吸光度，確定其純度。Real-time PCR檢測轉染前后的miR-21表達，取3 μg總RNA和3 μL逆轉錄酶混合，在10 μL逆轉錄體系中的反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，進行逆轉錄，然后將逆轉錄產物cDNA進行150倍稀釋。反應體系20 μL，包括2 μL稀釋的cDNA和10 μL預混液，ddH2O補足至20 μL。以U6 snRNA作為對照，2-ΔΔCt法計算miR-21相對表達量。HL-60細胞經上述步驟轉染后，分別與終濃度0.5、2.0和4.0 μmol/L的DCA作用48 h，每組設6個重復水平。

3.3 Annexin V/PI標記法觀察細胞凋亡 3.2步驟中細胞用預冷PBS洗滌棄上清，殘渣細胞收集至流式管。每管加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，避光靜置15 min，加300 μL預冷的PBS，振蕩混勻上機檢測其早/中晚期凋亡率。

3.4 分化抗原CD117和CD11b檢測 3.2步驟中細胞用預冷PBS洗滌棄上清，殘渣細胞收集至流式管。每管依次加CD117-PE和CD11b-PE各5 μL，加300 μL預冷的PBS，振蕩混勻上機檢測，用FlowJo軟件分析平均熒光強度。

3.5 人周期節(jié)律蛋白3(human period circadian protein 3，hPer3) mRNA檢測 hPer3和GAPDH標準品構建：用Trizol提取細胞總RNA，鑒定完整性和純度，取5 μg總RNA冰上逆轉錄成cDNA進行逆轉錄PCR，反應體系25 μL：其中DNA模板2 μL，10 μmol/L hPer3或GAPDH熒光定量PCR引物各1 μL，5×PCR緩沖液5 μL, 加去RNA酶水補至25 μL，反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR反應產物經純化后，加入連接緩沖液5 μL、純化的目的片斷4.5 μL和pMD18-T載體0.5 μL，低速離心后于16 ℃連接過夜，將連接液轉化大腸桿菌DH5α后涂氨芐青霉素平板，挑取單菌落培養(yǎng)過夜，抽提其質粒通過PCR鑒定陽性重組子，送上海生工公司測序確證。將重組質粒倍比梯度稀釋作為標準品，用cDNA進行SYBR Green I熒光染料嵌合法檢測，反應體系參照試劑說明書，反應條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。利用各自的標準曲線分別對樣品中的目的基因和內參照基因分別進行定量，白血病細胞株中hPer3 mRNA的相對表達量為hPer3與GAPDH比值。

4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0軟件，對各組中的抑制率、早期凋亡率及分化抗原平均熒光強度采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 轉染效率

空白組(blank組)、SCR轉染組(SCR組)和AMO轉染組(AMO組)的miR-21相對表達量(U6 snRNA為內參照)分別為0.71±0.07、0.66±0.05和0.35±0.07，AMO-21轉染組miR-21表達低于空白組和SCR轉染組(P<0.05)。

2 細胞藥敏

空白組、SCR組和AMO組DCA的IC50分別為(3.05±0.46) μmol/L、(2.96±0.34) μmol/L和(1.48±0.13) μmol/L，AMO組低于空白組和SCR組(P<0.01)。

3 Annexin V-FITC/PI檢測凋亡

各DCA濃度中，AMO組的早期凋亡率均高于同一藥物濃度組的空白組和SCR組(P<0.01)，見圖1、2。

Figure 1.Early apoptotic rates of HL-60 cells treated with diffe-rent concentrations of DCA. Mean±SD. n=6 **P<0.01 vs blank and SCR at the same DCA concentration.

Figure 2.Representative flow cytometry images of early apoptosis of HL-60 cells treated with DCA at concentrations of 0 and 4.0 μmol/L.

4 分化抗原CD117和CD11b檢測

除未加藥組(DCA 0 μmol/L)外，各藥物濃度組中AMO組的細胞CD117平均熒光強度(mean fluorescence intensity,MFI)均低于同一濃度組中的blank組和SCR組(P<0.01)。除未加藥組(DCA 0 μmol/L)外，各藥物濃度組中AMO組的細胞CD11b MFI均高于同一濃度組中的blank組和SCR組(P<0.01)，見圖3。

5 hPer3 mRNA檢測

各藥物濃度組中，AMO組的hPer3 mRNA表達均高于同一藥物濃度組的blank組和SCR組，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4。

Figure 3.Mean fluorescence intensities of CD117 (A) and CD11b (B) in HL-60 cells treated with different concentrations of DCA. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs blank and SCR at the same DCA concentration.

Figure 4.hPer3 mRNA relative expression in HL-60 cells treated with different concentrations of DCA. Mean±SD. n=6. *P<0.05， **P<0.01 vs blank and SCR at the same concentration.

討 論

DCA是目前發(fā)現(xiàn)的對MDS效果最佳的化療藥物，雖然在臨床上MDS和AML能相互轉歸，但從國外治療現(xiàn)狀來看，對AML單一使用DCA并未取得良好的效果，目前這種機制尚不清楚。目前的研究熱點在于如何使用其它藥物或手段增強DCA對AML的療效，使其達到或接近MDS的治療水平。在此方面近期的研究也取得一些進展，比如作為一種表觀遺傳學藥物，組蛋白去乙酰酶抑制劑丙戊酸鈉(VPA)聯(lián)用在體外[5]和體內[6]均能增強DCA的藥效。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類具有高度保守性的內源性非編碼蛋白質的小分子單鏈RNA，其中miR-21在幾乎所有實體腫瘤包括胰腺癌中存在高表達，而且高表達的miR-21可能發(fā)揮類似原癌基因的作用。在腫瘤細胞中針對性抑制miR-21表達不僅能直接抑制腫瘤細胞增殖的生物學特性，例如敲除或抑制miR-21能有效地抑制一些白血病細胞的生物學特性[7-8]，還能間接地增強一些化療藥物如阿糖胞苷[9]的抗腫瘤細胞的效果。本研究顯示，2 μmol/L AMO轉染時間為6 h后，HL-60細胞對DCA的IC50降至普通的一半左右，極大提升DCA抑制細胞的效果。同時，AMO和DCA還能共同作用于細胞早期凋亡和分化，CD117作為c-Kit受體膜外區(qū)分子表面抗原標志，多數(shù)AML的原始細胞中均有CD117的表達，并且CD117的高MFI和細胞的惡性程度相關，往往預示著預后不良[10]。AMO協(xié)同DCA降低CD117的MFI從分化抗原角度說明它們能共同作用于降低腫瘤細胞的惡性程度。CD11b是泛髓系標記，主要表達于粒系、單核等髓系細胞，其表達量和細胞成熟度呈正相關，AMO和DCA能共用提升HL-60細胞的CD11b MFI，并且從流式直方圖上顯示，4.0 μmol/L濃度DCA和AMO共同作用后，腫瘤細胞已經分化為一個幼稚群(低MFI峰)和一個成熟群(高MFI峰)，這意味著AMO和DCA能共同促進幼稚髓系腫瘤細胞向成熟髓系細胞轉化。

已有的研究顯示：miR-21常見的直接作用靶標有PTEN[11]、PDCD4、TIMP3、bcl-2等基因, 通過與靶基因mRNA 3’-UTR 完全或不完全互補配對而調控靶基因的表達。hPer3基因不僅作用于其它時鐘基因相關基因的調節(jié)，還直接作用于細胞周期調控，在體內表達降低易引起腫瘤細胞增殖，體外過表達也能引起腫瘤細胞的凋亡[12]。本研究顯示，單獨的AMO能提升hPer3 mRNA的表達，卻幅度不高。將與DCA作用的HL-60細胞經過AMO轉染預處理后，卻能較大幅度加強DCA促hPer3的表達能力。其原因可能如下：AMO對hPer3的表達影響可能有兩方面：正面作用：hPer3可能是miR-21的作用靶標(經TargetScan驗證其Pct值為0.69),AMO直接抑制miR-21從而提升了hPer3的表達；反面作用：由于miR-21還能通過直接抑制DNMT1基因上游信號分子RASGRP1而間接抑制DNMT1酶的表達[13]，而AMO的轉染恰恰提升了DNMT1酶的作用，抑制了hPer3的表達。未與DCA作用前，兩方面的作用相互制衡，以正面作用略占優(yōu)勢。DCA作為一種DNMT酶抑制劑，AMO轉染后與大劑量的DCA作用，其反面作用被抑制，從而在大劑量DCA組中觀察到hPer3表達的大幅提升?？傊?，AMO加強DCA的抗白血病效應中有hPer3的激活參與，然而， miR-21對hPer3的靶標作用過程目前尚未完全清楚，還需要在后續(xù)的實驗研究中進一步驗證。

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Enhanced anti-leukemic activity of decitabine to leukemia HL-60 cells by anti-miR-21 oligonucleotide

WANG Ye-kai, YU Qian, LIN Qi-long, YAO Yan-zhen, MEI Pei-yu, LI Yi-wei

(ClinicalLaboratory,ZhoushanHospital,Zhoushan316004,China.E-mail:wangyekai@163.com)

AIM: To investigate the role of anti-miR-21 oligonucleotide (AMO) in the anti-leukemic activity of decitabine (DCA)invitro. METHODS: AMO and scramble oligonucleotide (SCR) were constructed and transfected into HL-60 cells. The miR-21 expression was analyzed by real-time PCR to identify the transfection efficiency. The cells were treated with DCA at gradient concentrations (0.5, 2.0 and 4.0 μmol/L) for 48 h. The mRNA expression of human period circadian protein 3 (hPer3) was detected by real-time PCR. The early apoptotic rates were determined by flow cytometry with Annexin V/PI staining. Mean fluorescence intensities (MFI) of CD117 and CD11b were also measured by flow cytometry. RESULTS: The miR-21 relative expression level in AMO group was significantly lower than that in blank group and SCR group (P<0.01). IC50of DCA in AMO group was significantly lower than that in blank group and SCR group (P<0.01).With the same concentration of DCA, the early apoptotic rate, the mRNA expression of hPer3 and the MFI of CD11b in AMO group were significantly higher than those in blank group and SCR group (P<0.01). The MFI of CD117 in AMO group were significantly lower than those in blank group and SCR group (P<0.01). CONCLUSION: Activation of hPer3 expression plays an important role in enhanced anti-leukemic activity of decitabine by AMOinvitro.

Human period circadian protein 3; HL-60 cells; MicroRNA-21; Decitabine

1000- 4718(2015)01- 0109- 05

2014- 06- 06

2014- 10- 10

舟山市科技局科技計劃項目(No.2011C12044)

△通訊作者 Tel: 0580-2292892; E-mail: wangyekai@163.com

R733.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.021