• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    促性腺激素釋放激素類似物對人乳腺癌細胞的影響

    2015-04-17 07:49:50張曉娟董士中馬艷慶楊鹿鳴
    中國病理生理雜志 2015年1期
    關(guān)鍵詞:曲普瑞類似物磷酸化

    張曉娟, 董士中, 馬艷慶, 楊鹿鳴

    (平煤神馬醫(yī)療集團總醫(yī)院內(nèi)分泌科,河南 平頂山 467000)

    ?

    促性腺激素釋放激素類似物對人乳腺癌細胞的影響

    張曉娟△, 董士中, 馬艷慶, 楊鹿鳴

    (平煤神馬醫(yī)療集團總醫(yī)院內(nèi)分泌科,河南 平頂山 467000)

    目的: 探討促性腺激素釋放激素 (gonadotropin-releasing hormone, GnRH)類似物曲普瑞林(triptorelin)對人乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231細胞生長及細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)信號通路中重要信號分子ERK1/2和Akt活化的影響。方法: 使用不同濃度、不同時間的曲普瑞林刺激人乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細胞株,MTT法檢測細胞增殖,流式細胞術(shù)檢測細胞周期的分布,Western blotting檢測Akt和ERK1/2的磷酸化程度。結(jié)果: 曲普瑞林(10-5mol/L)作用人乳腺癌MCF-7細胞192 h、曲普瑞林(10-4mol/L)作用人乳腺癌MCF-7細胞168 h、192 h或曲普瑞林(10-4mol/L)作用人乳腺癌MDA-MB-231細胞192 h可明顯抑制細胞生長(P<0.05);曲普瑞林(10-4mol/L)作用人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞192 h,ERK1/2的磷酸化程度均較正常對照組低,Akt的磷酸化程度較正常對照組高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論: GnRH類似物曲普瑞林對人乳腺癌細胞的抑制作用,不僅僅是通過對垂體激素的降調(diào)節(jié)機制,還可能產(chǎn)生直接抑制作用。但該抑制作用未涉及ERK/MAPK和PI3K/Akt信號通路。

    MCF-7細胞; MDA-MB-231細胞; 促性腺激素釋放激素; 細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2; PI3K/Akt信號通路

    內(nèi)源性促性腺激素釋放激素 (gonadotropin-releasing hormone, GnRH)是由下丘腦特殊分化的神經(jīng)分泌細胞所合成并以脈沖方式釋放的十肽激素,儲存于神經(jīng)末梢的分泌顆粒中,當受到生理或中樞神經(jīng)遞質(zhì)刺激后,即通過門脈系統(tǒng)特異性地結(jié)合垂體前葉的GnRH受體。其主要生理功能為促使垂體合成和釋放促黃體生成素(luteotrophic hormone,LH)和卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,F(xiàn)SH)。GnRH類似物是人工合成的GnRH衍生物,可以與GnRH競爭GnRH受體,對垂體有雙相作用,小劑量短期應(yīng)用表現(xiàn)為促LH、FSH的刺激效應(yīng),當大劑量長時間給予GnRH尤其是GnRH類似物后,體內(nèi)將產(chǎn)生促性腺功能的抑制效應(yīng),從而抑制睪丸和卵巢的功能。由于其對垂體激素降調(diào)節(jié)作用,GnRH及其類似物的研究和應(yīng)用領(lǐng)域主要包括內(nèi)分泌依賴性腫瘤,如治療促性腺發(fā)育不良、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌等。

    GnRH類似物治療乳腺癌的機制,一般被認為是由于經(jīng)負反饋作用抑制下丘腦-垂體-性腺軸的功能,繼而降低血中雌激素的水平,抑制了乳腺癌的生長。但除此之外,GnRH類似物是否能夠?qū)θ橄侔┘毎a(chǎn)生直接的作用以及作用機制是什么,到目前仍存在著分歧,關(guān)于其它作用機制及合理用藥研究也較少,對該機制的研究將為臨床用藥的安全性提供重要的理論依據(jù)和科研價值。

    材 料 和 方 法

    1 主要實驗用品及化學(xué)試劑

    人乳腺癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231購自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心;GnRH類似物曲普瑞林(輝凌制藥);四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Akt、磷酸化Akt(ser473)、ERK1/2、磷酸化ERK1/2抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔、鼠IgG(上海碧云天生物技術(shù)公司)。

    2 細胞培養(yǎng)

    人乳腺癌MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清和1×105U/L青、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2濕潤的環(huán)境中培養(yǎng)。

    3 主要方法

    3.1 MTT法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌細胞,調(diào)整細胞濃度為2×107/L,接種于96孔板中,待細胞貼壁后分別加入含不同濃度(10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)曲普瑞林培養(yǎng)液200 μL,每組設(shè)6個復(fù)孔,分別作用細胞48 h、96 h、168 h、192 h,以上均設(shè)未處理對照組。每孔加入MTT液(5 g/L) 10 μL,振蕩后繼續(xù)37 ℃、5% CO2孵育4 h,吸去上清液,每孔加入DMSO 150 μL,振蕩5 min,用酶標儀在490 nm波長處測定各孔的吸光度(A)值,實驗重復(fù)3次。

    3.2 流式細胞儀測細胞周期 將處于對數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌細胞以每孔8×104個接種于6孔板,貼壁48 h,分別用 10-4mol/L曲普瑞林作用于細胞,設(shè)立陰性對照組,培養(yǎng)192 h,收集細胞,PBS洗滌2次,離心后的細胞沉淀用70%乙醇2 mL重懸,4 ℃過夜,50 g/L PI染液染色,4 ℃避光30 min,流式細胞儀檢測細胞周期分布。

    3.3 Western blotting檢測ERK1/2和Akt的表達 將處于對數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌細胞以每孔1×105個接種于6孔板,貼壁48 h,10-4mol/L曲普瑞林作用192 h,設(shè)立對照組,提取細胞總蛋白;BCA法測定蛋白濃度;每泳道上樣100 μg蛋白,SDS-PAGE分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,封閉,Ⅰ抗(1∶600)搖床4 ℃孵育過夜,TBST洗膜5 min 3次,加HRP標記的Ⅱ抗(1∶1 000)孵育1 h,以免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑進行放射自顯影。

    4 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析,實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 不同濃度、作用時間的曲普瑞林對人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖的影響

    濃度為10-5mol/L的曲普瑞林作用于人乳腺癌MCF-7細胞192 h或濃度為10-4mol/L的曲普瑞林作用168 h、192 h均可明顯抑制細胞生長,與對照組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且抑制作用呈現(xiàn)出時間依賴性關(guān)系;而濃度為10-6mol/L、10-7mol/L的曲普瑞林作用48 h、96 h、168 h、192 h均未表現(xiàn)出明顯抑制作用, 與對照組相比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;濃度為10-5mol/L曲普瑞林作用48 h、96 h、168 h及10-4mol/L的曲普瑞林作用48 h、96 h也未表現(xiàn)出明顯抑制作用,與對照組相比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖1。

    Figure 1.Comparison of absorbance in MCF-7 cells treated with different concentration of triptorelin at different time points. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group.

    濃度為10-4mol/L的曲普瑞林作用人乳腺癌MDA-MB-231細胞192 h可明顯抑制細胞生長,與對照組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。濃度為10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L的曲普瑞林分別作用人乳腺癌 MDA-MB-231細胞48 h、96 h、168 h、192 h或濃度為10-4mol/L曲普瑞林作用人乳腺癌MDA-MB-231細胞48 h、96 h、168 h與對照組相比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖2。

    Figure 2.Comparison of absorbance in MDA-MB-231 cells treated with different concentrations of triptorelin at diffe-rent time points. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

    2 曲普瑞林對人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞對細胞周期的影響

    濃度為10-4mol/L的曲普瑞林作用人乳腺癌MCF-7細胞192 h,反映細胞增殖活性的G2/M+S期細胞數(shù)目占(54.822±1.597)%,較對照組(84.228±0.962)% 明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明曲普瑞林能夠抑制人乳腺癌MCF-7細胞的生長,見表1。

    濃度為10-4mol/L的曲普瑞林作用人乳腺癌MDA-MB-231細胞192 h,反映細胞增殖活性的G2/M+S期細胞數(shù)目占(63.731±1.388)%,較對照組(87.686±0.830)%明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明曲普瑞林能夠抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞的生長,見表2。

    表1 曲普瑞林作用MCF-7細胞192 h后的細胞周期分析

    *P<0.05vscontrol group.

    表2 曲普瑞林作用MDA-MB-231細胞192 h后的細胞周期結(jié)果

    *P<0.05vscontrol group.

    3 曲普瑞林對人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞ERK1/2和Akt磷酸化的影響

    濃度為10-4mol/L的曲普瑞林作用于人乳腺癌MCF-7細胞192 h,對照組的ERK1/2磷酸化程度即p-ERK1/2/ERK1/2為(47.018±1.218)%,曲普瑞林組的ERK1/2磷酸化程度為(43.912±2.044)%,較對照組降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對照組的Akt磷酸化程度即p-Akt/Akt為(56.295±0.790)%,曲普瑞林組Akt磷酸化程度為(58.343±1.057)%,較對照組升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖3。

    濃度為10-4mol/L的曲普瑞林作用于人乳腺癌MDA-MB-231細胞192 h,對照組的ERK1/2磷酸化程度為44.381±1.255)%,曲普瑞林組的ERK1/2磷酸化程度為(42.656±0.795)%,較對照組降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;對照組的Akt磷酸化程度為(60.219±0.826)%,曲普瑞林組的Akt磷酸化程度為(61.764±0.698)%,較對照組升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖4。

    討 論

    乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤之一,嚴重威脅著人類的生命和生活質(zhì)量,死亡率占女性癌癥總死亡率的14%[1]。而對于乳腺癌的治療方法是以手術(shù)為主,放療、化療、激素治療為輔的綜合治療。目前臨床上應(yīng)用最多的治療乳腺癌的激素類藥物有抗雌激素類、孕激素類、芳香化酶抑制劑和GnRH類似物。醋酸曲普瑞林是GnRH的強力激動劑,其血漿半衰期延長,與GnRH受體親和力為天然GnRH的數(shù)十倍。目前臨床上應(yīng)用的GnRH類似物治療乳腺癌,主要是針對絕經(jīng)期前的乳腺癌患者,其有效率可達31%~63%。對于絕經(jīng)期后的患者,雖然療效不及絕經(jīng)期前的乳腺癌患者,但也可達到22%左右[2]。而GnRH類似物治療乳腺癌的機制,一般被認為是由于其抑制了下丘腦-垂體-性腺軸的功能,繼而降低靶腺分泌雌激素的水平,抑制了乳腺癌的生長。顯然,GnRH類似物此種作用機制并不能解釋對絕經(jīng)后患者的療效。

    Figure 3.The effects of triptorelin on the expression of p-Akt and p-ERK1/2 in MCF-7 cells. Mean±SD. n=3.

    MAPK和PI3K/Akt信號通路是人體內(nèi)重要的信號通路,能夠促進腫瘤細胞增殖和腫瘤血管形成,抑制腫瘤細胞凋亡,增強腫瘤侵襲性,在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用[3-4]。 MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶, 可被多種因素(細胞因子、生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細胞應(yīng)激和細胞黏附等)刺激而活化。由生長因子等介導(dǎo)的細胞增殖過程中,PI3K/Akt信號通路發(fā)揮了不可或缺的作用[5]。研究表明,在乳腺癌中,PI3K-Akt通路的活化率高達70%[6]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)GnRH結(jié)合位點存在于卵巢、前列腺、子宮內(nèi)膜、胰腺、垂體和肝臟等組織發(fā)生的腫瘤細胞上, GnRH類似物可促進這些癌細胞的凋亡。GnRH抑制腫瘤增殖的效應(yīng)可能是通過獨立于GnRH之外的作用機制完成的。關(guān)于GnRH與腫瘤的作用機制方面,近期有研究報道GnRH類似物與受體結(jié)合后,可能通過蛋白激酶C、MAPK、ERK等信號通路抑制腫瘤細胞增殖與分化[7]。在卵巢癌細胞中,Ⅱ型GnRH可以通過p38途徑調(diào)節(jié)細胞增殖[8]。GnRH受體在乳腺癌中已被鑒定出來。據(jù)報道,在體外實驗中,GnRH激動劑和GnRH拮抗劑可抑制乳腺癌上皮的生長,其效應(yīng)是通過受體調(diào)節(jié)直接作用于細胞生長和增殖環(huán)節(jié)[9]。同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在使用GnRH激動劑goserelin抑制前列腺癌細胞LNCaP時[10]。

    Figure 4.The effects of triptorelin on the expression of p-Akt and p-ERK1/2 in MDA-MB-231 cells. Mean±SD. n=3.

    GnRH類似物對人乳腺癌細胞增生的影響仍有爭議。大部分的研究表明, GnRH 類似物可以抑制乳腺癌細胞的增殖[11]。但是也有少部分研究表明, GnRH類似物并不影響乳腺癌細胞的增生[12-13]。本實驗中,選用了雌激素受體陽性的人乳腺癌MCF-7細胞和雌激素受體陰性的人乳腺癌MDA-MB-231細胞,測定GnRH類似物曲普瑞林對2種人乳腺癌細胞增殖及ERK/MAPK、PI3K/Akt信號通路中重要信號分子ERK1/2和Akt活化程度的影響。研究顯示GnRH類似物曲普瑞林對人乳腺癌細胞有抑制作用,這一結(jié)果與Ohta等[14]的結(jié)論相似,即觀察GnRH激動劑buserelin作用于人類子宮內(nèi)膜癌細胞系(Ishikawa 、EIIL、HEC-1A)、人乳腺癌細胞系(MCF-7)和卵巢癌細胞系(OVHS-1)24 h和168 h后的生長狀況,發(fā)現(xiàn)與陰性對照組相比,24 h給藥組沒有顯著差異,而168 h后都呈現(xiàn)抑制細胞生長的狀態(tài),因此GnRH類似物的生物效應(yīng)可能與藥物作用濃度和時間有關(guān)。用Western blotting法測定蛋白表達,濃度為10-4mol/L的曲普瑞林作用人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞192 h,均表現(xiàn)為ERK1/2的磷酸化程度較正常對照組下降,Akt的磷酸化程度較正常對照組升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示該抑制作用可能并不通過ERK/MAPK和PI3K/Akt信號通路完成,這有待進一步研究。

    [1] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2):69-90.

    [2] Burger CW, Prinssen HM, Kenemans P. LHRH agonist treatment of breast cancer and gynecological malignancies: a review[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 1996, 67(1):27-33.

    [3] Shen Q, Uray IP, Li Y, et al. The Ap-1 transcription factor regulates breast cancer cell growth via cyclins and E2F factors[J]. Oncogene, 2008, 27(3):366-377.

    [4] Park CM, Park MJ, Kwak HJ, et al. Ionizing radiation enhances matrix metalloproteinase-2 secretion and invasion of glioma cells through Src/epidermal growth factor receptor mediated p38/Akt and phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathways[J]. Cancer Res, 2006, 66(17):8511-8519.

    [5] 馮美江,丁新生.Akt與細胞生存[J].國外醫(yī)學(xué):分子生物學(xué)分冊,2002,24(5):283-285.

    [6] Lopez-Knowles E, OToole SA, MeNeil CM, et al. PI3K pathway activation in breast cancer is associated with the basal-like phenotype and cancer-specific mortality[J]. Int J Cancer, 2010, 126(5):1121-1231.

    [7] Leung PC, Choi JH. Endocrine signaling in ovarian surface epithelium and cancer[J]. Hum Reprod Update, 2007, 13(2):143-162.

    [8] Kim KY, Choi KC, Park SH, et al. Type II gonadotropin-releasing hormone stimulates p38 mitogen-activated protein kinase and apoptosis in ovarian cancer cells[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2004, 89(6):3020-3026.

    [9] Benshushan A, Brzezinski A. Hormonal manipulations and breast cancer[J]. Obstet Gynecol Surv, 2002, 57(5):314-323.

    [10]Grundker C, Volker P, Schulz KD, et al. Luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) agonist triptorelin and antagonist cetroelix inhibit EGF-induced c-fos expression in human gynecological cancers[J]. Gynec Oncol, 2000, 78(2):194-202.

    [11]Foekens JA, Henkelman MS, Fukkink JF, et al. Combined effects of buserelin, estradiol and tamoxifen on the growth of MCF-7 human breast cancer cellsinvitro[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1986, 140 (2):550-556.

    [12]Eidne KA, Flanagan CA, Harris NS, et al. Gonadotropin-releasing hormone ( GnRH ) - binding sites in human breast cancer cell lines and inhibitory effects of GnRH antagonists[J]. J Clin Endocrinol Metab, 1987, 64(3):425-432.

    [13]Sharoni Y, Bosin E, Miinster A, et al. Inhibition of growth of human mammary tumor cells by potent antagonists of luteinizing hormone- releasing hormone[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989, 86( 5):1648-1651.

    [14]Ohta H, Sakamoto H, Satoh K.Invitroeffects of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) analogue on cancer cell sensitivity to cis-platinum[J]. Cancer Lett, 1998, 134(1):111-118.

    Effect of gonadotropin-releasing hormone analogue on human breast cancer cell lineinvitro

    ZHANG Xiao-juan, DONG Shi-zhong, MA Yan-qing, YANG Lu-ming

    (DepartmentofEndocrinology,ChineseShenmaGroupGeneralHospitalofPingdingshanCoal,Pingdingshan467000,China.E-mail:zhangxj86822@126.com)

    AIM: To investigate the effects of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) analogue on the growth of breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-231invitroand to explore the related mechanisms with PI3K/Akt or ERK/MAPK pathways. METHODS: The proliferation of human breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-231 treatment with triptorelin was detected by MTT assay and the distribution of the cell cycle was determined by flow cytometry. The phosphorylation of the ERK1/2 and Akt was evaluated by Western blotting. RESULTS: Triptorelin inhibited the proliferation of MCF-7 cells at concentration of 10-5mol/L after treated for 192 h or at concentration of 10-4mol/L after treated for 168 h and 192 h. Triptorelin inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells at concentration of 10-4mol/L after treated for 192 h (P<0.05).Treatment with triptorelin for 192 h at concentration of 10-4mol/L had no statistical significance effect on phosphorylation of ERK1/2 and Akt(P>0.05).CONCLUSION: Inhibitory effect of GnRH analogue triptorelin on human breast cancer cells is not just the connection with the down-regulation of pituitary hormone, but also a direct inhibitory effect. The role may not be involved in the activation of ERK/MAPK and PI3K/Akt signaling pathways.

    MCF-7 cells; MDA-MB-231 cells; Gonadotropin-releasing hormone; Extracellulalr signal-regulated kinase 1/2; PI3K/Akt signaling pathway

    1000- 4718(2015)01- 0130- 05

    2014- 07- 26

    2014- 09- 10

    △通訊作者 Tel: 0375-2799332; E-mail: zhangxj86822@126.com

    R73-3

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.025

    猜你喜歡
    曲普瑞類似物磷酸化
    徐長風(fēng):核苷酸類似物的副作用
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:28
    ITSN1蛋白磷酸化的研究進展
    醋酸曲普瑞林有關(guān)物質(zhì)HPLC分析方法研究
    腹腔鏡聯(lián)合醋酸曲普瑞林治療子宮內(nèi)膜異位癥療效分析
    腹腔鏡術(shù)聯(lián)合醋酸曲普瑞林治療子宮內(nèi)膜異位癥臨床分析
    亮丙瑞林、曲普瑞林治療子宮肌瘤的對照研究
    MAPK抑制因子對HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4核轉(zhuǎn)位的影響
    維生素D類似物對心肌肥厚的抑制作用
    組蛋白磷酸化修飾與精子發(fā)生
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:59:01
    NADPH結(jié)構(gòu)類似物對FMN電子傳遞性質(zhì)影響的研究
    丝袜在线中文字幕| 电影成人av| bbb黄色大片| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | av电影中文网址| 窝窝影院91人妻| 久久久久久久久免费视频了| 欧美国产精品一级二级三级| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 正在播放国产对白刺激| 亚洲情色 制服丝袜| 人人澡人人妻人| 欧美久久黑人一区二区| 淫妇啪啪啪对白视频 | 亚洲精品一区蜜桃| 免费黄频网站在线观看国产| 精品视频人人做人人爽| 国产不卡av网站在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 成年人黄色毛片网站| 成人国产av品久久久| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲精品国产av蜜桃| 十八禁网站网址无遮挡| 久久久国产成人免费| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲三区欧美一区| 在线天堂中文资源库| 国产av又大| 久久热在线av| 老熟妇仑乱视频hdxx| www.999成人在线观看| 国产黄频视频在线观看| 国产99久久九九免费精品| 亚洲精品在线美女| 性高湖久久久久久久久免费观看| 热99re8久久精品国产| 国产av国产精品国产| 成人av一区二区三区在线看 | 搡老熟女国产l中国老女人| 好男人电影高清在线观看| 黄色视频不卡| 99热网站在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 国产日韩欧美在线精品| 欧美在线一区亚洲| 亚洲精品国产色婷婷电影| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 天堂中文最新版在线下载| 十分钟在线观看高清视频www| 精品卡一卡二卡四卡免费| 嫩草影视91久久| videosex国产| 成人国语在线视频| 亚洲欧美清纯卡通| 成年动漫av网址| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 国产成人精品在线电影| 各种免费的搞黄视频| 一本大道久久a久久精品| 男女午夜视频在线观看| 免费观看人在逋| 又爽又黄无遮挡网站| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| xxx96com| 一二三四在线观看免费中文在| 一区福利在线观看| tocl精华| 91在线观看av| 国产主播在线观看一区二区| 黄片大片在线免费观看| 亚洲国产欧美网| 亚洲真实伦在线观看| 嫩草影院精品99| 欧美日韩一级在线毛片| 国产1区2区3区精品| 国产三级中文精品| 两个人视频免费观看高清| 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲,欧美精品.| 成人手机av| 精品国产乱子伦一区二区三区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 九色成人免费人妻av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 91在线观看av| 国产免费av片在线观看野外av| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久久国产欧美日韩av| 这个男人来自地球电影免费观看| 免费在线观看日本一区| 亚洲自拍偷在线| 日本a在线网址| 亚洲精品国产一区二区精华液| av免费在线观看网站| 香蕉av资源在线| 毛片女人毛片| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 久久婷婷成人综合色麻豆| 久久香蕉国产精品| 欧美中文日本在线观看视频| 国产精品免费视频内射| 亚洲国产欧美人成| 亚洲免费av在线视频| 亚洲最大成人中文| 深夜精品福利| aaaaa片日本免费| 不卡av一区二区三区| 在线观看一区二区三区| 亚洲成av人片免费观看| 韩国av一区二区三区四区| 在线视频色国产色| 午夜免费激情av| 日日爽夜夜爽网站| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日韩av在线大香蕉| 成人欧美大片| 国产一区在线观看成人免费| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日日夜夜操网爽| av中文乱码字幕在线| 性色av乱码一区二区三区2| www.精华液| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 视频区欧美日本亚洲| 欧美黄色淫秽网站| 欧美不卡视频在线免费观看 | 一进一出抽搐动态| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲国产中文字幕在线视频| 麻豆一二三区av精品| 欧美成人午夜精品| 亚洲真实伦在线观看| 长腿黑丝高跟| 日韩高清综合在线| 精品欧美一区二区三区在线| 丁香六月欧美| 久久精品91蜜桃| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 制服丝袜大香蕉在线| 黄色片一级片一级黄色片| 男女那种视频在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲黑人精品在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产精品乱码一区二三区的特点| 五月玫瑰六月丁香| 久久草成人影院| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 一区福利在线观看| 天堂动漫精品| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产精品久久久久久久电影 | 在线观看美女被高潮喷水网站 | 久久久久久久精品吃奶| 国产av又大| 欧美大码av| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| x7x7x7水蜜桃| 国内精品久久久久精免费| 精品不卡国产一区二区三区| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 精品国内亚洲2022精品成人| 欧美成人午夜精品| 亚洲美女视频黄频| cao死你这个sao货| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产精品电影一区二区三区| 一二三四在线观看免费中文在| 丰满人妻一区二区三区视频av | 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲成人精品中文字幕电影| 夜夜爽天天搞| 国产av一区在线观看免费| 成人18禁在线播放| 麻豆成人av在线观看| avwww免费| 又大又爽又粗| svipshipincom国产片| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲,欧美精品.| 免费在线观看黄色视频的| 久久久久免费精品人妻一区二区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产三级中文精品| 国产精品九九99| 午夜精品在线福利| 最近最新中文字幕大全电影3| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| a级毛片a级免费在线| 狂野欧美激情性xxxx| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲 国产 在线| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美日韩国产亚洲二区| 午夜福利欧美成人| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日本一二三区视频观看| 久久久精品大字幕| av免费在线观看网站| 九色成人免费人妻av| 久99久视频精品免费| 国产熟女xx| 男女下面进入的视频免费午夜| 制服丝袜大香蕉在线| 女警被强在线播放| 亚洲人成网站高清观看| 又紧又爽又黄一区二区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| av视频在线观看入口| 午夜激情福利司机影院| 久久久久久久久中文| 亚洲全国av大片| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产成人aa在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 波多野结衣高清无吗| 视频区欧美日本亚洲| av福利片在线| 色综合婷婷激情| 亚洲全国av大片| 久久久久久大精品| 欧美黄色淫秽网站| 脱女人内裤的视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 一个人免费在线观看的高清视频| 99riav亚洲国产免费| 日韩欧美在线二视频| 成年版毛片免费区| 国产av一区二区精品久久| 日韩av在线大香蕉| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产视频一区二区在线看| 久久亚洲精品不卡| 国产精品久久视频播放| 中文在线观看免费www的网站 | 日本免费a在线| 免费看日本二区| 国产午夜精品论理片| 亚洲成人精品中文字幕电影| 在线免费观看的www视频| 午夜两性在线视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美日本视频| 午夜免费成人在线视频| 性色av乱码一区二区三区2| 91麻豆av在线| 亚洲自拍偷在线| 在线观看日韩欧美| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 69av精品久久久久久| 中文字幕高清在线视频| 日韩三级视频一区二区三区| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产一区二区在线观看日韩 | 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 桃色一区二区三区在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 99riav亚洲国产免费| 亚洲国产精品合色在线| 18禁美女被吸乳视频| 一级毛片精品| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产av在哪里看| 国产av又大| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 99精品欧美一区二区三区四区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 午夜福利18| 在线观看日韩欧美| 成人av一区二区三区在线看| 最近在线观看免费完整版| 一级黄色大片毛片| 免费看十八禁软件| 亚洲专区国产一区二区| 最近最新免费中文字幕在线| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲无线在线观看| 99国产精品99久久久久| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美最黄视频在线播放免费| 1024香蕉在线观看| 一本精品99久久精品77| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久久国产欧美日韩av| 国产区一区二久久| 午夜福利18| 精品无人区乱码1区二区| 悠悠久久av| 国产精华一区二区三区| 久久精品91蜜桃| 麻豆av在线久日| 欧美精品啪啪一区二区三区| 成人午夜高清在线视频| 亚洲最大成人中文| 大型av网站在线播放| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产黄色小视频在线观看| 9191精品国产免费久久| 久久久精品欧美日韩精品| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲中文av在线| 国内精品久久久久精免费| 免费电影在线观看免费观看| 91大片在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 精品欧美一区二区三区在线| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美黄色淫秽网站| 国产成人系列免费观看| 中出人妻视频一区二区| 搡老岳熟女国产| 欧美3d第一页| 精品久久久久久,| 免费在线观看成人毛片| av中文乱码字幕在线| 午夜老司机福利片| 波多野结衣高清无吗| 操出白浆在线播放| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 日韩有码中文字幕| 国产精品综合久久久久久久免费| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产高清视频在线播放一区| 日韩有码中文字幕| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 精品久久久久久成人av| 久久99热这里只有精品18| 亚洲精品国产一区二区精华液| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 少妇的丰满在线观看| 国产三级在线视频| 首页视频小说图片口味搜索| 欧美av亚洲av综合av国产av| 色av中文字幕| 草草在线视频免费看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产精品久久久久久精品电影| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| av国产免费在线观看| 少妇的丰满在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 午夜福利18| 国产单亲对白刺激| 一区福利在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 99热只有精品国产| 成人一区二区视频在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲av成人一区二区三| 我要搜黄色片| 曰老女人黄片| 久久精品成人免费网站| 妹子高潮喷水视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 999久久久国产精品视频| 成人av在线播放网站| 久久精品91蜜桃| 国产av又大| 日韩欧美 国产精品| 99精品久久久久人妻精品| 身体一侧抽搐| 成人av在线播放网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产视频内射| 国产又色又爽无遮挡免费看| 精品久久久久久久久久久久久| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久午夜综合久久蜜桃| 九色成人免费人妻av| 看片在线看免费视频| 欧美性猛交黑人性爽| 午夜日韩欧美国产| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲av五月六月丁香网| 嫁个100分男人电影在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美色视频一区免费| 999久久久国产精品视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 少妇人妻一区二区三区视频| 日本在线视频免费播放| 天堂动漫精品| 色综合婷婷激情| 日韩欧美免费精品| 亚洲最大成人中文| 又大又爽又粗| 999精品在线视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲 国产 在线| 两人在一起打扑克的视频| 精品久久久久久,| 校园春色视频在线观看| 宅男免费午夜| 可以在线观看毛片的网站| a级毛片a级免费在线| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 久久亚洲真实| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 日韩精品青青久久久久久| 夜夜夜夜夜久久久久| av国产免费在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲精品色激情综合| 啦啦啦韩国在线观看视频| a级毛片a级免费在线| 搞女人的毛片| 最近最新免费中文字幕在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 无遮挡黄片免费观看| 色av中文字幕| 亚洲男人天堂网一区| 国产精品野战在线观看| 免费高清视频大片| 国产高清videossex| 亚洲片人在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 动漫黄色视频在线观看| 午夜免费成人在线视频| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 视频区欧美日本亚洲| 日日夜夜操网爽| 欧美午夜高清在线| aaaaa片日本免费| 男人舔奶头视频| 99热6这里只有精品| 亚洲av五月六月丁香网| 日韩av在线大香蕉| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲精华国产精华精| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久亚洲真实| 亚洲最大成人中文| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产成+人综合+亚洲专区| 日本a在线网址| 成人国产综合亚洲| 久久久水蜜桃国产精品网| 久久久久性生活片| 一级黄色大片毛片| 午夜免费激情av| 国产一区二区三区视频了| 国产精品久久视频播放| 老司机在亚洲福利影院| 大型av网站在线播放| 曰老女人黄片| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 日本熟妇午夜| 99国产精品一区二区蜜桃av| 成人永久免费在线观看视频| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲在线自拍视频| 久久精品影院6| 日日夜夜操网爽| 久久天堂一区二区三区四区| 国产单亲对白刺激| 在线视频色国产色| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美在线黄色| 美女扒开内裤让男人捅视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 天天一区二区日本电影三级| 日本免费a在线| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久久中文字幕一级| 亚洲成av人片在线播放无| 淫秽高清视频在线观看| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲无线在线观看| 91在线观看av| 国产黄色小视频在线观看| 手机成人av网站| 日本 欧美在线| 精品不卡国产一区二区三区| 在线观看免费日韩欧美大片| 身体一侧抽搐| 操出白浆在线播放| 男女午夜视频在线观看| 久久久国产成人精品二区| 99re在线观看精品视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产欧美日韩一区二区三| 中文字幕久久专区| 国产三级黄色录像| 黑人操中国人逼视频| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲最大成人中文| a级毛片在线看网站| av免费在线观看网站| 一本久久中文字幕| 在线观看www视频免费| 成人av在线播放网站| 一区二区三区高清视频在线| 成人av在线播放网站| 2021天堂中文幕一二区在线观| 婷婷丁香在线五月| 少妇被粗大的猛进出69影院| 精品电影一区二区在线| cao死你这个sao货| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 免费人成视频x8x8入口观看| 日本成人三级电影网站| 欧美乱妇无乱码| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美3d第一页| 久久亚洲精品不卡| 级片在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 中文字幕av在线有码专区| 国产欧美日韩一区二区三| 欧美一级a爱片免费观看看 | 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日韩免费av在线播放| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲专区字幕在线| 欧美在线一区亚洲| 精品福利观看| 精品久久久久久久末码| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 听说在线观看完整版免费高清| 国产亚洲精品av在线| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 在线a可以看的网站| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美激情久久久久久爽电影| 欧美日韩乱码在线| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产一区二区在线av高清观看| 国产亚洲精品一区二区www| 极品教师在线免费播放| 特级一级黄色大片| 在线观看午夜福利视频| 全区人妻精品视频| 久久九九热精品免费| 久久婷婷成人综合色麻豆| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲全国av大片| aaaaa片日本免费| 99re在线观看精品视频| 国产片内射在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 黄色毛片三级朝国网站| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久精品成人免费网站| 麻豆久久精品国产亚洲av| 99热6这里只有精品| 啦啦啦免费观看视频1| 正在播放国产对白刺激| 久久精品影院6| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 日韩av在线大香蕉| 久久精品91蜜桃| 99热6这里只有精品| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲第一电影网av| 国产欧美日韩精品亚洲av| 日韩欧美在线乱码| 成人午夜高清在线视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 99精品久久久久人妻精品| 久久久久亚洲av毛片大全| 婷婷丁香在线五月| 在线永久观看黄色视频| 国产激情久久老熟女| 亚洲精品色激情综合| 丁香六月欧美| 黄色视频,在线免费观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 999久久久精品免费观看国产| 国产成人av教育| 国产一区在线观看成人免费| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久久国产精品麻豆| 曰老女人黄片| 久久午夜亚洲精品久久| 午夜福利18| 中文在线观看免费www的网站 | 中文字幕av在线有码专区| 大型av网站在线播放| 老司机靠b影院| 狂野欧美激情性xxxx|