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    促性腺激素釋放激素類似物對人乳腺癌細胞的影響

    2015-04-17 07:49:50張曉娟董士中馬艷慶楊鹿鳴
    中國病理生理雜志 2015年1期
    關(guān)鍵詞:曲普瑞類似物磷酸化

    張曉娟, 董士中, 馬艷慶, 楊鹿鳴

    (平煤神馬醫(yī)療集團總醫(yī)院內(nèi)分泌科,河南 平頂山 467000)

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    促性腺激素釋放激素類似物對人乳腺癌細胞的影響

    張曉娟△, 董士中, 馬艷慶, 楊鹿鳴

    (平煤神馬醫(yī)療集團總醫(yī)院內(nèi)分泌科,河南 平頂山 467000)

    目的: 探討促性腺激素釋放激素 (gonadotropin-releasing hormone, GnRH)類似物曲普瑞林(triptorelin)對人乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231細胞生長及細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)信號通路中重要信號分子ERK1/2和Akt活化的影響。方法: 使用不同濃度、不同時間的曲普瑞林刺激人乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細胞株,MTT法檢測細胞增殖,流式細胞術(shù)檢測細胞周期的分布,Western blotting檢測Akt和ERK1/2的磷酸化程度。結(jié)果: 曲普瑞林(10-5mol/L)作用人乳腺癌MCF-7細胞192 h、曲普瑞林(10-4mol/L)作用人乳腺癌MCF-7細胞168 h、192 h或曲普瑞林(10-4mol/L)作用人乳腺癌MDA-MB-231細胞192 h可明顯抑制細胞生長(P<0.05);曲普瑞林(10-4mol/L)作用人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞192 h,ERK1/2的磷酸化程度均較正常對照組低,Akt的磷酸化程度較正常對照組高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論: GnRH類似物曲普瑞林對人乳腺癌細胞的抑制作用,不僅僅是通過對垂體激素的降調(diào)節(jié)機制,還可能產(chǎn)生直接抑制作用。但該抑制作用未涉及ERK/MAPK和PI3K/Akt信號通路。

    MCF-7細胞; MDA-MB-231細胞; 促性腺激素釋放激素; 細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2; PI3K/Akt信號通路

    內(nèi)源性促性腺激素釋放激素 (gonadotropin-releasing hormone, GnRH)是由下丘腦特殊分化的神經(jīng)分泌細胞所合成并以脈沖方式釋放的十肽激素,儲存于神經(jīng)末梢的分泌顆粒中,當受到生理或中樞神經(jīng)遞質(zhì)刺激后,即通過門脈系統(tǒng)特異性地結(jié)合垂體前葉的GnRH受體。其主要生理功能為促使垂體合成和釋放促黃體生成素(luteotrophic hormone,LH)和卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,F(xiàn)SH)。GnRH類似物是人工合成的GnRH衍生物,可以與GnRH競爭GnRH受體,對垂體有雙相作用,小劑量短期應(yīng)用表現(xiàn)為促LH、FSH的刺激效應(yīng),當大劑量長時間給予GnRH尤其是GnRH類似物后,體內(nèi)將產(chǎn)生促性腺功能的抑制效應(yīng),從而抑制睪丸和卵巢的功能。由于其對垂體激素降調(diào)節(jié)作用,GnRH及其類似物的研究和應(yīng)用領(lǐng)域主要包括內(nèi)分泌依賴性腫瘤,如治療促性腺發(fā)育不良、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌等。

    GnRH類似物治療乳腺癌的機制,一般被認為是由于經(jīng)負反饋作用抑制下丘腦-垂體-性腺軸的功能,繼而降低血中雌激素的水平,抑制了乳腺癌的生長。但除此之外,GnRH類似物是否能夠?qū)θ橄侔┘毎a(chǎn)生直接的作用以及作用機制是什么,到目前仍存在著分歧,關(guān)于其它作用機制及合理用藥研究也較少,對該機制的研究將為臨床用藥的安全性提供重要的理論依據(jù)和科研價值。

    材 料 和 方 法

    1 主要實驗用品及化學(xué)試劑

    人乳腺癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231購自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心;GnRH類似物曲普瑞林(輝凌制藥);四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Akt、磷酸化Akt(ser473)、ERK1/2、磷酸化ERK1/2抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔、鼠IgG(上海碧云天生物技術(shù)公司)。

    2 細胞培養(yǎng)

    人乳腺癌MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清和1×105U/L青、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2濕潤的環(huán)境中培養(yǎng)。

    3 主要方法

    3.1 MTT法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌細胞,調(diào)整細胞濃度為2×107/L,接種于96孔板中,待細胞貼壁后分別加入含不同濃度(10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)曲普瑞林培養(yǎng)液200 μL,每組設(shè)6個復(fù)孔,分別作用細胞48 h、96 h、168 h、192 h,以上均設(shè)未處理對照組。每孔加入MTT液(5 g/L) 10 μL,振蕩后繼續(xù)37 ℃、5% CO2孵育4 h,吸去上清液,每孔加入DMSO 150 μL,振蕩5 min,用酶標儀在490 nm波長處測定各孔的吸光度(A)值,實驗重復(fù)3次。

    3.2 流式細胞儀測細胞周期 將處于對數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌細胞以每孔8×104個接種于6孔板,貼壁48 h,分別用 10-4mol/L曲普瑞林作用于細胞,設(shè)立陰性對照組,培養(yǎng)192 h,收集細胞,PBS洗滌2次,離心后的細胞沉淀用70%乙醇2 mL重懸,4 ℃過夜,50 g/L PI染液染色,4 ℃避光30 min,流式細胞儀檢測細胞周期分布。

    3.3 Western blotting檢測ERK1/2和Akt的表達 將處于對數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌細胞以每孔1×105個接種于6孔板,貼壁48 h,10-4mol/L曲普瑞林作用192 h,設(shè)立對照組,提取細胞總蛋白;BCA法測定蛋白濃度;每泳道上樣100 μg蛋白,SDS-PAGE分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,封閉,Ⅰ抗(1∶600)搖床4 ℃孵育過夜,TBST洗膜5 min 3次,加HRP標記的Ⅱ抗(1∶1 000)孵育1 h,以免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑進行放射自顯影。

    4 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析,實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 不同濃度、作用時間的曲普瑞林對人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖的影響

    濃度為10-5mol/L的曲普瑞林作用于人乳腺癌MCF-7細胞192 h或濃度為10-4mol/L的曲普瑞林作用168 h、192 h均可明顯抑制細胞生長,與對照組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且抑制作用呈現(xiàn)出時間依賴性關(guān)系;而濃度為10-6mol/L、10-7mol/L的曲普瑞林作用48 h、96 h、168 h、192 h均未表現(xiàn)出明顯抑制作用, 與對照組相比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;濃度為10-5mol/L曲普瑞林作用48 h、96 h、168 h及10-4mol/L的曲普瑞林作用48 h、96 h也未表現(xiàn)出明顯抑制作用,與對照組相比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖1。

    Figure 1.Comparison of absorbance in MCF-7 cells treated with different concentration of triptorelin at different time points. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group.

    濃度為10-4mol/L的曲普瑞林作用人乳腺癌MDA-MB-231細胞192 h可明顯抑制細胞生長,與對照組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。濃度為10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L的曲普瑞林分別作用人乳腺癌 MDA-MB-231細胞48 h、96 h、168 h、192 h或濃度為10-4mol/L曲普瑞林作用人乳腺癌MDA-MB-231細胞48 h、96 h、168 h與對照組相比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖2。

    Figure 2.Comparison of absorbance in MDA-MB-231 cells treated with different concentrations of triptorelin at diffe-rent time points. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

    2 曲普瑞林對人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞對細胞周期的影響

    濃度為10-4mol/L的曲普瑞林作用人乳腺癌MCF-7細胞192 h,反映細胞增殖活性的G2/M+S期細胞數(shù)目占(54.822±1.597)%,較對照組(84.228±0.962)% 明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明曲普瑞林能夠抑制人乳腺癌MCF-7細胞的生長,見表1。

    濃度為10-4mol/L的曲普瑞林作用人乳腺癌MDA-MB-231細胞192 h,反映細胞增殖活性的G2/M+S期細胞數(shù)目占(63.731±1.388)%,較對照組(87.686±0.830)%明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明曲普瑞林能夠抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞的生長,見表2。

    表1 曲普瑞林作用MCF-7細胞192 h后的細胞周期分析

    *P<0.05vscontrol group.

    表2 曲普瑞林作用MDA-MB-231細胞192 h后的細胞周期結(jié)果

    *P<0.05vscontrol group.

    3 曲普瑞林對人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞ERK1/2和Akt磷酸化的影響

    濃度為10-4mol/L的曲普瑞林作用于人乳腺癌MCF-7細胞192 h,對照組的ERK1/2磷酸化程度即p-ERK1/2/ERK1/2為(47.018±1.218)%,曲普瑞林組的ERK1/2磷酸化程度為(43.912±2.044)%,較對照組降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對照組的Akt磷酸化程度即p-Akt/Akt為(56.295±0.790)%,曲普瑞林組Akt磷酸化程度為(58.343±1.057)%,較對照組升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖3。

    濃度為10-4mol/L的曲普瑞林作用于人乳腺癌MDA-MB-231細胞192 h,對照組的ERK1/2磷酸化程度為44.381±1.255)%,曲普瑞林組的ERK1/2磷酸化程度為(42.656±0.795)%,較對照組降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;對照組的Akt磷酸化程度為(60.219±0.826)%,曲普瑞林組的Akt磷酸化程度為(61.764±0.698)%,較對照組升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖4。

    討 論

    乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤之一,嚴重威脅著人類的生命和生活質(zhì)量,死亡率占女性癌癥總死亡率的14%[1]。而對于乳腺癌的治療方法是以手術(shù)為主,放療、化療、激素治療為輔的綜合治療。目前臨床上應(yīng)用最多的治療乳腺癌的激素類藥物有抗雌激素類、孕激素類、芳香化酶抑制劑和GnRH類似物。醋酸曲普瑞林是GnRH的強力激動劑,其血漿半衰期延長,與GnRH受體親和力為天然GnRH的數(shù)十倍。目前臨床上應(yīng)用的GnRH類似物治療乳腺癌,主要是針對絕經(jīng)期前的乳腺癌患者,其有效率可達31%~63%。對于絕經(jīng)期后的患者,雖然療效不及絕經(jīng)期前的乳腺癌患者,但也可達到22%左右[2]。而GnRH類似物治療乳腺癌的機制,一般被認為是由于其抑制了下丘腦-垂體-性腺軸的功能,繼而降低靶腺分泌雌激素的水平,抑制了乳腺癌的生長。顯然,GnRH類似物此種作用機制并不能解釋對絕經(jīng)后患者的療效。

    Figure 3.The effects of triptorelin on the expression of p-Akt and p-ERK1/2 in MCF-7 cells. Mean±SD. n=3.

    MAPK和PI3K/Akt信號通路是人體內(nèi)重要的信號通路,能夠促進腫瘤細胞增殖和腫瘤血管形成,抑制腫瘤細胞凋亡,增強腫瘤侵襲性,在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用[3-4]。 MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶, 可被多種因素(細胞因子、生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細胞應(yīng)激和細胞黏附等)刺激而活化。由生長因子等介導(dǎo)的細胞增殖過程中,PI3K/Akt信號通路發(fā)揮了不可或缺的作用[5]。研究表明,在乳腺癌中,PI3K-Akt通路的活化率高達70%[6]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)GnRH結(jié)合位點存在于卵巢、前列腺、子宮內(nèi)膜、胰腺、垂體和肝臟等組織發(fā)生的腫瘤細胞上, GnRH類似物可促進這些癌細胞的凋亡。GnRH抑制腫瘤增殖的效應(yīng)可能是通過獨立于GnRH之外的作用機制完成的。關(guān)于GnRH與腫瘤的作用機制方面,近期有研究報道GnRH類似物與受體結(jié)合后,可能通過蛋白激酶C、MAPK、ERK等信號通路抑制腫瘤細胞增殖與分化[7]。在卵巢癌細胞中,Ⅱ型GnRH可以通過p38途徑調(diào)節(jié)細胞增殖[8]。GnRH受體在乳腺癌中已被鑒定出來。據(jù)報道,在體外實驗中,GnRH激動劑和GnRH拮抗劑可抑制乳腺癌上皮的生長,其效應(yīng)是通過受體調(diào)節(jié)直接作用于細胞生長和增殖環(huán)節(jié)[9]。同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在使用GnRH激動劑goserelin抑制前列腺癌細胞LNCaP時[10]。

    Figure 4.The effects of triptorelin on the expression of p-Akt and p-ERK1/2 in MDA-MB-231 cells. Mean±SD. n=3.

    GnRH類似物對人乳腺癌細胞增生的影響仍有爭議。大部分的研究表明, GnRH 類似物可以抑制乳腺癌細胞的增殖[11]。但是也有少部分研究表明, GnRH類似物并不影響乳腺癌細胞的增生[12-13]。本實驗中,選用了雌激素受體陽性的人乳腺癌MCF-7細胞和雌激素受體陰性的人乳腺癌MDA-MB-231細胞,測定GnRH類似物曲普瑞林對2種人乳腺癌細胞增殖及ERK/MAPK、PI3K/Akt信號通路中重要信號分子ERK1/2和Akt活化程度的影響。研究顯示GnRH類似物曲普瑞林對人乳腺癌細胞有抑制作用,這一結(jié)果與Ohta等[14]的結(jié)論相似,即觀察GnRH激動劑buserelin作用于人類子宮內(nèi)膜癌細胞系(Ishikawa 、EIIL、HEC-1A)、人乳腺癌細胞系(MCF-7)和卵巢癌細胞系(OVHS-1)24 h和168 h后的生長狀況,發(fā)現(xiàn)與陰性對照組相比,24 h給藥組沒有顯著差異,而168 h后都呈現(xiàn)抑制細胞生長的狀態(tài),因此GnRH類似物的生物效應(yīng)可能與藥物作用濃度和時間有關(guān)。用Western blotting法測定蛋白表達,濃度為10-4mol/L的曲普瑞林作用人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞192 h,均表現(xiàn)為ERK1/2的磷酸化程度較正常對照組下降,Akt的磷酸化程度較正常對照組升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示該抑制作用可能并不通過ERK/MAPK和PI3K/Akt信號通路完成,這有待進一步研究。

    [1] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2):69-90.

    [2] Burger CW, Prinssen HM, Kenemans P. LHRH agonist treatment of breast cancer and gynecological malignancies: a review[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 1996, 67(1):27-33.

    [3] Shen Q, Uray IP, Li Y, et al. The Ap-1 transcription factor regulates breast cancer cell growth via cyclins and E2F factors[J]. Oncogene, 2008, 27(3):366-377.

    [4] Park CM, Park MJ, Kwak HJ, et al. Ionizing radiation enhances matrix metalloproteinase-2 secretion and invasion of glioma cells through Src/epidermal growth factor receptor mediated p38/Akt and phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathways[J]. Cancer Res, 2006, 66(17):8511-8519.

    [5] 馮美江,丁新生.Akt與細胞生存[J].國外醫(yī)學(xué):分子生物學(xué)分冊,2002,24(5):283-285.

    [6] Lopez-Knowles E, OToole SA, MeNeil CM, et al. PI3K pathway activation in breast cancer is associated with the basal-like phenotype and cancer-specific mortality[J]. Int J Cancer, 2010, 126(5):1121-1231.

    [7] Leung PC, Choi JH. Endocrine signaling in ovarian surface epithelium and cancer[J]. Hum Reprod Update, 2007, 13(2):143-162.

    [8] Kim KY, Choi KC, Park SH, et al. Type II gonadotropin-releasing hormone stimulates p38 mitogen-activated protein kinase and apoptosis in ovarian cancer cells[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2004, 89(6):3020-3026.

    [9] Benshushan A, Brzezinski A. Hormonal manipulations and breast cancer[J]. Obstet Gynecol Surv, 2002, 57(5):314-323.

    [10]Grundker C, Volker P, Schulz KD, et al. Luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) agonist triptorelin and antagonist cetroelix inhibit EGF-induced c-fos expression in human gynecological cancers[J]. Gynec Oncol, 2000, 78(2):194-202.

    [11]Foekens JA, Henkelman MS, Fukkink JF, et al. Combined effects of buserelin, estradiol and tamoxifen on the growth of MCF-7 human breast cancer cellsinvitro[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1986, 140 (2):550-556.

    [12]Eidne KA, Flanagan CA, Harris NS, et al. Gonadotropin-releasing hormone ( GnRH ) - binding sites in human breast cancer cell lines and inhibitory effects of GnRH antagonists[J]. J Clin Endocrinol Metab, 1987, 64(3):425-432.

    [13]Sharoni Y, Bosin E, Miinster A, et al. Inhibition of growth of human mammary tumor cells by potent antagonists of luteinizing hormone- releasing hormone[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989, 86( 5):1648-1651.

    [14]Ohta H, Sakamoto H, Satoh K.Invitroeffects of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) analogue on cancer cell sensitivity to cis-platinum[J]. Cancer Lett, 1998, 134(1):111-118.

    Effect of gonadotropin-releasing hormone analogue on human breast cancer cell lineinvitro

    ZHANG Xiao-juan, DONG Shi-zhong, MA Yan-qing, YANG Lu-ming

    (DepartmentofEndocrinology,ChineseShenmaGroupGeneralHospitalofPingdingshanCoal,Pingdingshan467000,China.E-mail:zhangxj86822@126.com)

    AIM: To investigate the effects of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) analogue on the growth of breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-231invitroand to explore the related mechanisms with PI3K/Akt or ERK/MAPK pathways. METHODS: The proliferation of human breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-231 treatment with triptorelin was detected by MTT assay and the distribution of the cell cycle was determined by flow cytometry. The phosphorylation of the ERK1/2 and Akt was evaluated by Western blotting. RESULTS: Triptorelin inhibited the proliferation of MCF-7 cells at concentration of 10-5mol/L after treated for 192 h or at concentration of 10-4mol/L after treated for 168 h and 192 h. Triptorelin inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells at concentration of 10-4mol/L after treated for 192 h (P<0.05).Treatment with triptorelin for 192 h at concentration of 10-4mol/L had no statistical significance effect on phosphorylation of ERK1/2 and Akt(P>0.05).CONCLUSION: Inhibitory effect of GnRH analogue triptorelin on human breast cancer cells is not just the connection with the down-regulation of pituitary hormone, but also a direct inhibitory effect. The role may not be involved in the activation of ERK/MAPK and PI3K/Akt signaling pathways.

    MCF-7 cells; MDA-MB-231 cells; Gonadotropin-releasing hormone; Extracellulalr signal-regulated kinase 1/2; PI3K/Akt signaling pathway

    1000- 4718(2015)01- 0130- 05

    2014- 07- 26

    2014- 09- 10

    △通訊作者 Tel: 0375-2799332; E-mail: zhangxj86822@126.com

    R73-3

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.025

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