通心絡(luò)聯(lián)合阿托伐他汀、阿司匹林對家兔動脈粥樣硬化早期血管外膜炎癥因子表達(dá)的干預(yù)*

郎艷松， 秘紅英， 劉美之， 袁國強(qiáng)

[1河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊 050017； 2河北以嶺醫(yī)藥研究院，國家中醫(yī)藥管理局重點研究室(心腦血管絡(luò)病)，河北 石家莊 050035； 3河北醫(yī)科大學(xué)附屬以嶺醫(yī)院心血管科(國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)絡(luò)病學(xué)重點學(xué)科)，河北 石家莊 050091； 4河北省絡(luò)病重點實驗室，河北 石家莊 050035]

?

·短篇論著·

通心絡(luò)聯(lián)合阿托伐他汀、阿司匹林對家兔動脈粥樣硬化早期血管外膜炎癥因子表達(dá)的干預(yù)*

郎艷松1, 2， 秘紅英1, 2， 劉美之1, 2， 袁國強(qiáng)3, 4△

[1河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊 050017；2河北以嶺醫(yī)藥研究院，國家中醫(yī)藥管理局重點研究室(心腦血管絡(luò)病)，河北 石家莊 050035；3河北醫(yī)科大學(xué)附屬以嶺醫(yī)院心血管科(國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)絡(luò)病學(xué)重點學(xué)科)，河北 石家莊 050091；4河北省絡(luò)病重點實驗室，河北 石家莊 050035]

目的： 探討通心絡(luò)聯(lián)合阿托伐他汀、阿司匹林對家兔動脈粥樣硬化早期頸動脈外膜炎癥因子表達(dá)的影響。方法: 高脂飲食復(fù)合單側(cè)頸總動脈硅膠管包裹制備兔動脈粥樣硬化早期模型。72只新西蘭兔隨機(jī)分為對照組(control)、模型組(model)、通心絡(luò)(tongxinluo)組、阿托伐他汀(atorvastatin)組、阿司匹林(aspirin)組和三藥聯(lián)用(three-drug combination)組。每組各12只。對照組給予普通飼料，模型組及各用藥組家兔均實施單側(cè)頸動脈硅膠管包裹術(shù)復(fù)合高脂飼料喂養(yǎng)，通心絡(luò)組給予通心絡(luò)超微粉混懸液(0.3 g·kg-1·d-1)灌胃，阿托伐他汀組給予阿托伐他汀(2.5 mg·kg-1·d-1)灌胃，阿司匹林組給予阿司匹林(12 mg·kg-1·d-1)灌胃，三藥聯(lián)用組給予通心絡(luò)超微粉混懸液(0.3 g·kg-1·d-1)、阿托伐他汀(2.5 mg·kg-1·d-1)和阿司匹林(12.5 mg·kg-1·d-1)灌胃，連續(xù)給藥，4周后取材。HE染色判定頸動脈內(nèi)中膜病理形態(tài)變化；生化法檢測血脂變化；ELISA法測定各組家兔頸動脈包裹段外膜單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和IL-10表達(dá)水平；免疫組化法檢測血管外膜IL-8表達(dá)水平。結(jié)果: 模型組與對照組比較，血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的水平明顯增高。除阿司匹林組外，各用藥組TC、TG和LDL-C的水平與模型組比較明顯降低。三藥聯(lián)用組較其它用藥組TC、TG和LDL-C的水平明顯降低。模型組頸動脈外膜中MCP-1和IL-1β的表達(dá)明顯高于對照組，IL-10的表達(dá)減弱。與模型組比較，各用藥組頸動脈外膜中MCP-1和IL-1β的表達(dá)減弱，IL-10的表達(dá)增強(qiáng)。三藥聯(lián)用組較其它各用藥組MCP-1和IL-1β的表達(dá)明顯減弱，IL-10的表達(dá)明顯增強(qiáng)。各用藥組頸動脈外膜IL-8表達(dá)減少。結(jié)論: 通心絡(luò)、阿托伐他汀和阿司匹林三藥聯(lián)用可通過降脂、調(diào)節(jié)血管外膜炎癥反應(yīng)而有效延緩動脈粥樣硬化進(jìn)程，且較單藥應(yīng)用作用更佳。

外膜； 炎癥； 動脈粥樣硬化； 單核細(xì)胞趨化蛋白-1； 白細(xì)胞介素-8； 白細(xì)胞介素-10

隨著對動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)病模式研究的不斷深入，“由內(nèi)而外”的炎癥發(fā)病機(jī)制逐漸向“由外而內(nèi)”轉(zhuǎn)變。外膜炎癥浸潤程度與AS嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，外膜炎癥細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，影響內(nèi)膜的變化，還可以通過神經(jīng)末梢及直接作用于平滑肌受體影響中膜，促進(jìn)AS的發(fā)生、發(fā)展[1]。在動脈粥樣硬化早期血管外膜即有單核細(xì)胞趨化蛋白 1(monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1)等的表達(dá)，基于polypill策略[2]即在固定藥物劑量的基礎(chǔ)上聯(lián)合用藥，減少危險因素的同時未導(dǎo)致不良反應(yīng)的風(fēng)險提高，從而控制心血管病危險因素，減少心腦血管的發(fā)病風(fēng)險。既往吳以嶺院士提出他汀類藥物聯(lián)合應(yīng)用阿司匹林及中藥通心絡(luò)膠囊，形成有效防治缺血性心腦血管疾病的通心絡(luò)聯(lián)合阿托伐他汀、阿司匹林聯(lián)合應(yīng)用的優(yōu)選方案。我們試圖通過本實驗研究該方案對動脈粥樣硬化早期血管外膜炎癥因子表達(dá)的影響，探討該方案對動脈粥樣硬化進(jìn)程的干預(yù)作用。

材 料 和 方 法

1 動物與分組

72只雌雄各半的健康新西蘭白兔，體重(1.8±0.2)kg，購自北京富豪實驗動物養(yǎng)殖中心。單籠飼養(yǎng)在河北省絡(luò)病重點實驗室。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為6組：對照(control)組、模型(model)組、通心絡(luò)(tongxinluo)組、阿托伐他汀(atorvastatin)組、阿司匹林(aspirin)組和三藥聯(lián)用(three-drug combination)組，每組12只。對照組給予普通飼料，其余各組硅膠管包裹后給予高脂飼料(膽固醇1%、蛋黃粉7.5%、豬油5%及基礎(chǔ)飼料86.5%，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心加工定制)[3]。同時根據(jù)人與動物用藥量體表面積計算法，臨灌胃時用0.5%的羧甲基纖維素鈉水溶液將通心絡(luò)超微粉、阿托伐他汀和阿司匹林配成相應(yīng)給藥劑量(所用濃度為臨床等效量)的混懸液，濃度依次為：0.3 g·kg-1·d-1、2.5 mg·kg-1·d-1和12 mg·kg-1·d-1，三藥聯(lián)用組用通心絡(luò)超微粉混懸液(0.3 g·kg-1·d-1)、阿托伐他汀(2.5 mg·kg-1·d-1)和阿司匹林(12 mg·kg-1·d-1)灌胃。每日定量給予150 g普通飼料或高脂飼料喂養(yǎng)，同時灌胃給藥，自由飲水，連續(xù)喂養(yǎng)4周。

2 藥品、試劑與儀器

通心絡(luò)超微粉(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號：20120924)；阿托伐他汀片(輝瑞制藥有限公司，批號：1237179)；阿司匹林(石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號：018130311)；羧甲基纖維素鈉(天津永大化學(xué)試劑開發(fā)中心，批號：20130418)；總膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒、甘油三酯(trigly-ceride，TG)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)試劑盒(北京九強(qiáng)生物有限公司)；MCP-1和白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-10 ELISA試劑盒(Cloud-Clone)；考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

3K15型高速冷凍離心機(jī)(Sigma)；日立7080型全自動生化分析儀(Hitachi)；XD711酶標(biāo)分析儀(上海迅達(dá)醫(yī)療儀器公司)；MDF-U50V型-80 ℃冰箱(SANYO)；IF300-150型制冰機(jī)(iLshin)。

3 方法

3.1 硅膠管包裹術(shù) 自耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)，將新西蘭白兔仰臥位固定于手術(shù)臺上，脫毛后常規(guī)消毒，鋪洞巾。沿其頸部正中線剪開皮膚并逐層鈍性分離，右側(cè)頸動脈鞘暴露后，仔細(xì)游離出右頸動脈約2.5 cm。用準(zhǔn)備好的硅膠管縱向切開后包裹于動脈外，滴加青霉素預(yù)防感染，縫合傷口。術(shù)后動物自主蘇醒。術(shù)后每天2次、連續(xù)3 d局部消毒，預(yù)防感染。

3.2 樣品采集 喂養(yǎng)4周后，采集前12 h禁食禁水，3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉(1 mL/kg)，腹主動脈取血。嚴(yán)格無菌操作，剃毛后消毒，沿頸部正中線剪開，快速分離并取下包管側(cè)頸動脈，并一分為二，生理鹽水洗凈，一部分10%甲醛溶液保存，另一部分液氮凍存?zhèn)溆?。剩余組織制作石蠟切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。

3.3 病理標(biāo)本光鏡觀察 取固定標(biāo)本，脫水、石蠟包埋，切片約4 μm，HE染色，光鏡觀察。

3.4 血脂測定 取全血后，4 ℃、3 500 r/min，離心10 min，取上清液分裝入EP管，采用全自動生化分析儀測定TC、TG和LDL-C水平。

3.5 炎癥指標(biāo)測定 檢測指標(biāo)前取出液氮凍存標(biāo)本，各組動物組織取相同大小，置于預(yù)冷的PBS液中，去除管周組織，縱向剖開血管，仔細(xì)剝離外膜，吸干稱重。放置于試管中加入生理鹽水，比例為1∶9，制成10%的組織勻漿。3 000 r/min離心15 min，取上清液待測。嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附試劑盒進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀測吸光度(A)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算組織勻漿中的濃度。考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，計算每克蛋白中MCP-1、IL-1β和IL-10的含量。免疫組化法檢測血管外膜IL-8表達(dá)。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，如方差不齊者用Dunnett’s T3檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組兔頸動脈光鏡觀察

對照組可見內(nèi)皮細(xì)胞完整，胞核扁平，與內(nèi)彈力板貼合緊密，中層平滑肌細(xì)胞排列整齊；模型組的內(nèi)皮細(xì)胞有脫落，內(nèi)膜層明顯增厚,可見少量泡沫狀巨噬細(xì)胞形成；各用藥組內(nèi)膜層部分增厚，但動脈損傷程度減輕，以阿托伐他汀組、通心絡(luò)組及三藥聯(lián)用組改善更為明顯，見圖1。

2 血脂

模型組血清的TC、TG和LDL-C水平與對照組比較顯著增高(P<0.01)；除阿司匹林組外，各用藥組均有一定降脂作用，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但三藥聯(lián)用組與其它用藥組分別比較降脂作用更為突出(P<0.01)；其余各用藥組之間兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

3 外膜炎癥指標(biāo)的變化

與正常組比較，模型組MCP-1和IL-1β的表達(dá)明顯增多，IL-10的表達(dá)減少(P<0.01)；各用藥組均見MCP-1和IL-1β表達(dá)減少，IL-10表達(dá)增加，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；三藥聯(lián)用組與其他用藥組分別比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；其余各用藥組之間兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

與對照組比較，模型組IL-8在血管外膜新生滋養(yǎng)血管處表達(dá)增多；與模型組比較，各用藥組外膜新生滋養(yǎng)血管數(shù)量減少(IL-8在微血管內(nèi)皮細(xì)胞陽性表達(dá)呈現(xiàn)棕褐色，凡是呈現(xiàn)棕色的并與臨近組織有明顯界限，可視為一個微血管[4])，同時IL-8表達(dá)減少，見圖2。

Figure 1.The appearance of carotid artery morphology in various groups (HE staining，×400). A: control group; B: model group; C: tongxinluo group; D: atorvastatin group; E: aspirin group; F: three-drug combination group.

表1 各組血脂水平

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05，##P<0.01vsmodel group;△△P<0.01vsthree-drug combination group.

表2 各組頸動脈外膜的MCP-1、IL-1β和IL-10水平

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△△P<0.01vsthree-drug combination group.

討 論

通常實驗選用高膽固醇飼料喂養(yǎng)制備動脈粥樣硬化模型，新西蘭白兔是制備動脈粥樣硬化模型的常用動物之一[5-6]，本研究中我們聯(lián)合“頸動脈硅膠管包裹和高脂喂養(yǎng)”在較短時間內(nèi)制備動脈粥樣硬化早期模型[7]。HE結(jié)果顯示4周模型組動脈粥樣硬化程度與人類動脈粥樣硬化早期征象——血管壁內(nèi)膜層增厚和脂紋形成的病理改變相似[8]。

近年來對于動脈粥樣硬化“由外向內(nèi)”炎癥機(jī)制探索不斷增多。動脈外膜炎癥是誘發(fā)動脈粥樣硬化發(fā)生的早期事件之一[9]。已有研究表明血管外膜炎癥的出現(xiàn)先于動脈粥樣硬化病理形態(tài)學(xué)改變[10]，在動脈粥樣硬化形成時，腹主動脈外膜有大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤[11]，外膜浸潤的炎癥細(xì)胞除B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞外[12]，還有肥大細(xì)胞[13]，浸潤程度與動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度相對應(yīng)，這些炎癥細(xì)胞又可分泌IL-1、IL-8和MCP-1等細(xì)胞因子[14]。

在動脈粥樣硬化早期MCP-1即表達(dá)，此外受到TNF-α、IL-1、干擾素等的刺激誘導(dǎo)時，MCP-1表達(dá)均會明顯增加[15]，其隨后出現(xiàn)分泌大量MCP-1的巨噬細(xì)胞[16]，而MCP-1與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。高脂等干預(yù)引起血流機(jī)械力的改變誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞生成MCP-1[17]，吸引滋養(yǎng)血管內(nèi)的單核細(xì)胞經(jīng)血管壁游出并聚集到動脈外膜進(jìn)而成為巨噬細(xì)胞后又釋放大量的MCP-1，引起單核細(xì)胞遷移進(jìn)入內(nèi)膜下，大量炎癥細(xì)胞在血管內(nèi)膜聚集，進(jìn)而導(dǎo)致動脈內(nèi)膜層增厚，促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[18]。他汀類藥物、阿司匹林和通心絡(luò)均能通過不同作用機(jī)制發(fā)揮其抗炎作用[19-20]，實驗結(jié)果證實各用藥組能夠明顯減少血管外膜MCP-1表達(dá)，三藥聯(lián)用組作用更為突出。

Figure 2.The appearance of IL-8 in carotid arterial adventitia in various groups (IHC，×400).A: control group; B: model group; C: tongxinluo group; D: atorvastatin group; E: aspirin group; F: three-drug combination group.

需要提出的是，MCP-1還能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞自身合成,過程由IL-10調(diào)節(jié)[21]，IL-10作為參與動脈粥樣硬化的單一抑炎因子，可抑制多種炎癥因子的表達(dá)，同時IL-10能抑制單核細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附[22]，在動脈粥樣硬化進(jìn)程中起保護(hù)作用。各用藥組均能通過增加IL-10的表達(dá)發(fā)揮其保護(hù)作用，三藥聯(lián)用組效果優(yōu)于三藥單用。

炎癥反應(yīng)發(fā)生時IL-8在血管內(nèi)皮細(xì)胞大量表達(dá)，因此在血管外膜可見在滋養(yǎng)血管周圍IL-8呈現(xiàn)黃褐色表達(dá)，IL-8和MCP-1作用相似，能促使單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上的滾動轉(zhuǎn)變成強(qiáng)有力的黏附，同時IL-8也能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，是一種強(qiáng)有力的促血管生成因子，在動脈粥樣硬化中發(fā)揮著重要作用[23]。外膜上的IL-1β能夠誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞在外膜的聚集，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖。實驗中各用藥組能夠減少IL-8和IL-1β，減少內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，其中三藥聯(lián)用組優(yōu)于三藥單用組。以往的臨床和基礎(chǔ)實驗已證實該優(yōu)選方案在降脂和穩(wěn)定斑塊方面作用明顯[24]，效果優(yōu)于三藥單用[25]。本實驗結(jié)果證實在動脈粥樣硬化早期，三藥聯(lián)用組的降脂效果明顯優(yōu)于三藥單用，同時三藥聯(lián)用組能夠明顯減少血管外膜組織中MCP-1、IL-8和IL-1β表達(dá)，增加IL-10表達(dá)，起到調(diào)節(jié)血管外膜炎癥作用，進(jìn)而延緩動脈粥樣硬化進(jìn)程。

既往研究證實在豬高脂血癥模型上，新生滋養(yǎng)血管在動脈粥樣硬化早期就已出現(xiàn)，新生的滋養(yǎng)血管也是促炎物質(zhì)及促動脈粥樣硬化血液成分進(jìn)入血管壁的通路[26]。MCP-1表達(dá)受血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)調(diào)節(jié)，血管外膜上可見PDGFβ表達(dá)，PDGF也參與血管新生[27]，同時IL-8也是一種促血管生成因子，那么該優(yōu)選方案能否通過抑制血管外膜炎癥及干預(yù)外膜滋養(yǎng)血管新生而發(fā)揮延緩動脈粥樣硬化進(jìn)程的作用，值得我們進(jìn)一步研究。

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Interventional effects of tongxinluo combined with atorvastatin and aspirin on adventitial inflammation in early stage of atherosclerosis

LANG Yan-song1, 2, MI Hong-ying1, 2, LIU Mei-zhi1，2, YUAN Guo-qiang3, 4

[1HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China;2DepartmentofCardiology,YilingMedicalInstituteofHebeiProvince,KeyLaboratoryofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine(Cardio-cerebralVascularCollateralDisease),Shijiazhuang050035,China;3DepartmentofCardiology，YilingHospitalofHebeiMedicalUniversity(CollateralDiseaseTheoryKeyDisciplineofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine),Shijiazhuang050091,China;4KeyLaboratoryofCollateralDiseaseofHebeiProvince,Shijiazhuang050035,China.E-mail:yuanguoqiang7508@163.com]

AIM: To investigate the effect of a treatment proposal, which consisted of tongxinluo, atorvastatin and aspirin, on adventitial inflammation of early atherosclerosis in rabbit carotid artery. METHODS: The atherosclerotic model was established in the rabbits with silicone collar， which was positioned around the carotid arterial adventitia + high-cholesterol diet. New Zealand rabbits (n=72) were randomly divided into 6 groups (n=12): control group, model group, tongxinluo group, atorvastatin group, aspirin group, and three-drug combination group. The rabbits in control group were fed with common foodstuffs, and the rabbits in all the other groups were fixed the right carotid arteries with the silicone tube, and were fed with fatty foodstuffs. The rabbits in tongxinluo group, atorvastatin group and aspirin group were given the suspension of tongxinluo supermicropowder (0.3 g·kg-1·d-1), atorvastatin (2.5 mg·kg-1·d-1) and aspirin (12 mg·kg-1·d-1) respectively，and the rabbits in three-drug combination group were given the suspension of tongxinluo supermicropowder (0.3 g·kg-1·d-1), atorvastatin (2.5 mg·kg-1·d-1) and aspirin (12 mg·kg-1·d-1) together. The rabbits in each group were fed with the corresponding medicines for 4 weeks. The tissue slices of carotid artery were observed under light microscope with HE staining. The change of blood lipid was detected by biochemical assay. The protein levels of MCP-1, IL-1β and IL-10 in the carotid arterial adventitia were detected by ELISA. The immunohistochemical staining was used to detect the protein expression of IL-8 around the carotid arterial adventitia.RESULTS: Compared with control group, the contents of TC, TG and LDL-C were significantly increased, and the content of IL-10 was significantly decreased in model group. The levels of TC, TG and LDL-C were significantly decreased in tongxinluo group and atorvastatin group compared with model group, no significant difference between tongxinluo group and atorvastatin group was observed. In the three-drug combination group, the levels of TC, TG and LDL-C were lower than those in atorvastatin group and tongxinluo group. Compared with control group, the contents of MCP-1 and IL-1β were significantly increased, and the content of IL-10 was significantly decreased in model group. Compared with model group, the contents of MCP-1 and IL-1β were decreased in tongxinluo group, atorvastatin group and aspirin group, no significant difference between the 3 groups was observed. The content of IL-10 was decreased in three-drug combination group, and the contents of TC, TG and LDL-C were lower than those in tongxinluo group, atorvastatin group and aspirin group. The content of IL-8 was decreased in tongxinluo group, atorvastatin group, aspirin group and three-drug combination group.CONCLUSION: The strategy of three-drug combination enhances the effect of regulating the lipid metabolism and inhibiting the adventitia inflammation. It plays an important role to intervene in the process of atherosclerosis.

Adventitia; Inflammation; Atherosclerosis; Monocyte chemoattractant protein 1; Interleukin-8; Interleukin-10

1000- 4718(2015)01- 0154- 06

2014- 07- 02

2014- 10- 09

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(No. 2012CB518606)

△通訊作者 Tel: 0311-85901553； E-mail: yuanguoqiang7508@163.com

R543

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.029