小鼠牙胚在腎包膜及口腔黏膜環(huán)境下成牙能力的比較研究*

何 穎， 劉朋飛， 劉 曉， 樸正根△， 蔡景蕾

(1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510632； 2吉林大學(xué)藥學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春 130021； 3中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院再生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510530)

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小鼠牙胚在腎包膜及口腔黏膜環(huán)境下成牙能力的比較研究*

何 穎1， 劉朋飛2， 劉 曉1， 樸正根1△， 蔡景蕾3△

(1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510632；2吉林大學(xué)藥學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春 130021；3中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院再生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510530)

目的： 通過(guò)對(duì)比分析腎包膜和口腔黏膜環(huán)境對(duì)小鼠牙胚成牙的適宜度，期望為牙齒再生技術(shù)探尋較為理想的培養(yǎng)環(huán)境。方法: 構(gòu)建小鼠牙胚腎包膜下及口腔黏膜下移植模型，將14.5 d胚齡(ED14.5)的胚鼠下頜第1磨牙牙胚分別移入腎包膜及口腔黏膜下，于植入后3、4周取材，進(jìn)行大體標(biāo)本觀察、組織學(xué)切片分析、硬度、彈性模量測(cè)定及拉曼光譜分析等，以觀察牙胚的成牙情況。結(jié)果: (1)牙胚在腎包膜下及口腔黏膜下均可發(fā)育成牙齒狀結(jié)構(gòu)，但口腔黏膜組在各時(shí)點(diǎn)牙冠體積均小于腎包膜組，且牙齒尖窩發(fā)育狀態(tài)不如腎包膜組明顯。(2)組織切片染色顯示：在口腔黏膜下形成的牙釉質(zhì)層和牙本質(zhì)層比腎包膜組薄，成釉細(xì)胞及成牙本質(zhì)細(xì)胞分化不明顯。(3)在釉質(zhì)的硬度比較上，僅口腔黏膜4周組的釉質(zhì)硬度比正常鼠牙低(P<0.05)；在釉質(zhì)的彈性模量比較上，腎包膜下3周后的移植物釉質(zhì)彈性模量比成年鼠牙略低，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，腎包膜下4周和口腔黏膜下4周后的移植物釉質(zhì)彈性模量均低于正常鼠牙和腎包膜3周的釉質(zhì)彈性模量(P<0.01)；各組間牙本質(zhì)的硬度及彈性模量無(wú)顯著差異(P>0.05)。(4)拉曼光譜分析結(jié)果顯示：2組的拉曼光譜趨勢(shì)基本一致，在961 cm-1處有最大峰值，但是在2 947 cm-1處，口腔黏膜3周組有明顯的峰值，遠(yuǎn)高于其它各組。結(jié)論: (1)對(duì)于ED14.5的牙胚來(lái)說(shuō)，相對(duì)口腔黏膜環(huán)境而言，腎包膜下環(huán)境培育3～4周更能發(fā)育成相對(duì)完整的牙齒。(2)口腔黏膜環(huán)境所形成牙齒的諸多性狀與腎包膜環(huán)境下發(fā)育的牙齒相比雖有差異，但其對(duì)牙胚的生長(zhǎng)發(fā)育還是具有一定的影響。

組織工程； 牙胚； 腎包膜； 口腔黏膜； 移植

近年來(lái)，基于牙齒發(fā)育和干細(xì)胞理論的牙齒再生技術(shù)逐漸受到重視[1]，同時(shí)，建立一種適宜的器官培養(yǎng)模式也是該領(lǐng)域的重點(diǎn)問(wèn)題，故探尋較為理想的牙胚培養(yǎng)環(huán)境對(duì)于該技術(shù)有著重要的意義。近幾十年來(lái)，學(xué)者們對(duì)組織工程牙齒培養(yǎng)的有利環(huán)境進(jìn)行了大量的研究，迄今為止，相對(duì)成熟的移植環(huán)境有腎包膜下、腹腔大網(wǎng)膜內(nèi)、眼前房區(qū)、皮下組織等同種異體移植區(qū)。其中，腎包膜下環(huán)境被公認(rèn)為較有利于移植牙胚的生長(zhǎng)，在這一環(huán)境下，移植物能保持較好的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特性，并且移植物的位置相對(duì)固定不易移動(dòng)，故在此部位能開展較多的重組實(shí)驗(yàn)；腹腔大網(wǎng)膜區(qū)域多用于研究牙胚及骨組織復(fù)合材料等相對(duì)較大的移植物，因腹腔內(nèi)體積較大，對(duì)于較小的移植物，很可能因在動(dòng)物腹腔中的位置不定而導(dǎo)致檢測(cè)移植形成物時(shí)比較困難；而背部皮下移植環(huán)境也存在相似的問(wèn)題[2]。前述這些牙齒異位移植的環(huán)境能為移植牙胚的生長(zhǎng)提供一個(gè)良好的環(huán)境，但是在發(fā)育學(xué)上與生理學(xué)上與牙齒生長(zhǎng)的真正環(huán)境相差較大，而且尚不知是否存在負(fù)面影響，如是否含有正常的血管和神經(jīng)，是否具有正常牙齒的硬度等。另一方面，口腔環(huán)境才是其生長(zhǎng)真正的生長(zhǎng)環(huán)境，只有在口腔環(huán)境中萌出的牙齒才最具有臨床意義。目前，口腔內(nèi)移植環(huán)境研究得較多的是頜骨內(nèi)移植和口腔黏膜下移植。對(duì)于小鼠頜骨內(nèi)移植手術(shù)來(lái)說(shuō)，由于兩側(cè)黏膜縫合較難而使得移植后創(chuàng)口封閉性差，易導(dǎo)致牙胚丟失，且牙槽窩內(nèi)可能存在營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足等而使得該部位移植實(shí)驗(yàn)也未能廣泛開展。將出生后4 d小鼠的牙胚移植入口腔黏膜，能觀察到牙齒的發(fā)育，但因出生后4 d小鼠的牙胚其結(jié)構(gòu)接近發(fā)育完成，故不能完全評(píng)價(jià)口腔黏膜環(huán)境是否可以支持牙胚的發(fā)育[3-5]。

為進(jìn)一步驗(yàn)證口腔黏膜環(huán)境對(duì)牙胚發(fā)育的作用，并比較牙胚在腎包膜下及口腔黏膜環(huán)境中的成牙能力，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)將胚胎期(embronic day, ED)14.5 d的胚鼠牙胚分別移入腎包膜及口腔黏膜下(圖1)，并觀察對(duì)比在這2種環(huán)境中牙胚發(fā)育的最終情況，從而評(píng)價(jià)口腔黏膜是否可以作為組織工程化牙胚的體內(nèi)再生環(huán)境。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠，雌雄不限，6～8周齡，體重約20 g，由中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院動(dòng)物中心提供。

2 主要儀器設(shè)備與實(shí)驗(yàn)材料

常規(guī)手術(shù)器械購(gòu)自上海醫(yī)療器械廠；體視顯微鏡及成像系統(tǒng)購(gòu)自Zeiss；納米壓痕儀購(gòu)自Hysitron；拉曼光譜儀購(gòu)自JY；PBS溶液購(gòu)自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；胎牛血清購(gòu)自PAA；EDTA及4%多聚甲醛緩沖液購(gòu)自廣州威佳科技有限公司；水合氯醛購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)五聯(lián)化工廠；蘇木素-伊紅染液購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

3 主要方法

3.1 牙胚的獲取與培養(yǎng) 用健康ICR小鼠，體重約20 g，懷孕14.5 d后斷頸處死，浸入75 %的乙醇中消毒10 min，于超凈工作臺(tái)內(nèi)剖開其子宮取出胎鼠，放入1×PBS液中反復(fù)漂洗，取胎鼠頭部，進(jìn)而在體視鏡下分離上、下頜，剝離下頜第一磨牙牙胚，組織塊大小約1 mm×1 mm×1 mm，將其置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5 % CO2溫箱中培養(yǎng)。

3.2 牙胚體內(nèi)移植

3.2.1 牙胚腎包膜下移植 以5%水合氯醛腹腔注射麻醉ICR小鼠后，切開其腰背部皮膚，暴露右側(cè)腎臟，用顯微外科鑷輕輕挑起腎囊膜，并用鈍頭玻璃針輕輕刺破腎囊膜形成一直徑約0.2 mm的小孔，將牙胚從小孔中推進(jìn)腎囊膜下，1個(gè)腎大約可移植約12～14個(gè)牙胚，移植完后縫合關(guān)閉創(chuàng)口，見(jiàn)圖1。

3.2.2 牙胚口腔黏膜下移植 ICR小鼠以腹腔注射5%水合氯醛麻醉后，仰臥位固定，常規(guī)外科消毒，選取下頜兩切牙左、右側(cè)前庭溝附近頰黏膜為移植部位，用手術(shù)刀沿矢狀方向切開黏膜表層約2 mm長(zhǎng)，細(xì)彎剪向切口兩邊潛行分離，未見(jiàn)明顯出血，生理鹽水沖洗3次，隨機(jī)選取牙胚植入后縫合，一側(cè)頰黏膜可移植約1～2個(gè)牙胚，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Schematic diagram of transplantation of tooth germs in subrenal capsule and oral submucosa environments.

3.3 組織學(xué)觀察 分別于術(shù)后3、4周脫頸處死小鼠后暴露移植區(qū)域，取出移植物，將移植物固定于4%的中性緩沖多聚甲醛液中，10% EDTA低溫脫鈣，常規(guī)梯度脫水，包埋劑包埋后制作5 μm連續(xù)冰凍切片，HE染色。

3.4 硬度及彈性模量的測(cè)定 樣品于4 ℃保存在麝香草酚溶液中，實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水沖洗并在空氣中晾干，使用硬組織切片機(jī)切取樣品，應(yīng)用納米壓痕技術(shù)，對(duì)硬度和彈性模量進(jìn)行測(cè)量，使用掃描電子顯微鏡對(duì)標(biāo)本進(jìn)行形貌觀察，進(jìn)行壓痕測(cè)量時(shí)，為了明確區(qū)分和確定所測(cè)量的部位，基本都是選中層測(cè)量，實(shí)驗(yàn)選擇恒載荷模式，連續(xù)測(cè)量最大加載力及加載后的位移，得到載荷-位移曲線，用經(jīng)典的Oliver-Pharr方法[6]計(jì)算硬度及彈性模量。

3.5 拉曼光譜測(cè)定 樣品于4 ℃保存在麝香草酚溶液中，實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水沖洗并在空氣中晾干，表面打磨光滑，選取釉質(zhì)及牙本質(zhì)表層進(jìn)行測(cè)量，使用硅片，用50倍物鏡，20 s曝光時(shí)間，100%激光功率取譜，檢查峰位，并設(shè)置實(shí)驗(yàn)條件后，執(zhí)行采譜命令，應(yīng)用Labspec軟件分析數(shù)據(jù)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

結(jié) 果

1 移植物的形態(tài)學(xué)觀察

腎包膜組：牙胚移植后整體情況生長(zhǎng)良好，分離取出小鼠腎臟，可見(jiàn)囊泡包裹的移植物，生長(zhǎng)于腎囊膜下層，體積約為3.0 mm×1.5 mm×1.0 mm(圖2A)。3周后，牙冠部呈現(xiàn)未被磨損的小鼠磨牙的典型形態(tài)，牙尖發(fā)育完好，牙體外感堅(jiān)硬，色白且有光澤。4周后，牙胚的發(fā)育狀態(tài)大體與3周的狀態(tài)相同，牙冠發(fā)育完好，體積較3周略大，牙冠與牙根交界處平坦，見(jiàn)圖3。

口腔黏膜組：在牙胚移植后的一段時(shí)間內(nèi)，口腔黏膜下的傷口即可完全愈合，可見(jiàn)移植牙胚生長(zhǎng)于表面黏膜層與頰肌之間(圖2B)，體積約為2.0 mm×1.5 mm×1.0 mm，組織相容性好，表面無(wú)明顯的炎癥反應(yīng)。牙胚在移植3周和移植4周后所形成的牙齒結(jié)構(gòu)形態(tài)基本相同。但是，牙胚的發(fā)育與同時(shí)期腎包膜下相比，牙體形態(tài)較小，牙尖發(fā)育不如腎包膜組完整，質(zhì)感稍軟，在牙冠與牙根交界處平坦，尚未見(jiàn)牙根形成，見(jiàn)圖3。

Figure 2.The structure of 3 weeks after transplantation of tooth germs in subrenal capsule (A) and oral submucosa (B) environments, as indicated by the arrows. Scale bar=1 mm.

2 移植物的組織學(xué)觀察

腎包膜組：3～4周后移植物組織學(xué)HE染色可見(jiàn)明顯的釉質(zhì)空白區(qū)(脫鈣后)、牙本質(zhì)、牙本質(zhì)小管、牙髓內(nèi)組織以及分化良好的成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞等結(jié)構(gòu)，其中成釉細(xì)胞呈高柱狀，整齊地排列在脫鈣的釉質(zhì)層外側(cè)，隨著牙本質(zhì)細(xì)胞體積增大，細(xì)胞外間隙逐漸變小，細(xì)胞向基底膜一側(cè)伸出的短粗突起結(jié)構(gòu)清楚，牙髓細(xì)胞密集，牙冠周圍被類似骨樣組織包裹，見(jiàn)圖3。

口腔黏膜組：3～4周后移植物組織學(xué)HE染色同樣可見(jiàn)正常組織等結(jié)構(gòu)，此外，上皮根鞘延伸，離開牙冠向牙髓方向彎曲，形成一盤狀結(jié)構(gòu)，和腎包膜組相比，在黏膜下形成的牙釉質(zhì)層和牙本質(zhì)層較薄，成釉細(xì)胞及成牙本質(zhì)細(xì)胞分化不明顯，牙髓內(nèi)細(xì)胞較少，呈現(xiàn)纖維組織交織成網(wǎng)狀，見(jiàn)圖3。

3 移植物硬度和彈性模量分析

選取硬度測(cè)試分析的實(shí)驗(yàn)組有正常鼠牙、腎包膜3周組和口腔黏膜4周組，口腔黏膜生長(zhǎng)3周的牙冠質(zhì)感較軟，硬度明顯弱于腎包膜組，4周的質(zhì)感較3周略硬，所以選取此階段樣品進(jìn)行對(duì)比分析。

Figure 3.Tooth structure after transplantation of tooth germs in subrenal capsule and oral submucosa, and the images of the sections with HE staining. n=9～12. Scale bar=0.5 mm. K-3wks: 3 weeks after tooth germ transplantation in subrenal capsule； M-3wks: 3 weeks after tooth germ transplantation in oral submucosa； K-4wks: 4 weeks after tooth germ transplantation in subrenal capsule； M-4wks: 4 weeks after tooth germ transplantation in oral submucosa； Am: ameloblast; dp: dental pulp； od: odontoblast； d: dentin； es: enamel.

各實(shí)驗(yàn)組的納米壓痕掃描電鏡觀察如圖4所示，結(jié)果表明：經(jīng)過(guò)人為的打磨拋光，牙齒界面破壞后，已未能見(jiàn)到典型的釉質(zhì)與牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)。在各實(shí)驗(yàn)組中，均能見(jiàn)到大小不一的三角形壓痕，正常鼠牙中釉質(zhì)與牙本質(zhì)三角壓痕較小且較少，腎包膜下3～4周、口腔黏膜下4周的標(biāo)本三角壓痕較大。

Figure 4.The images of enamel and dentin by scanning electron microscopy. Scale bar=0.1 mm.

牙釉質(zhì)及牙本質(zhì)硬度和彈性模量的改變?nèi)鐖D5、6所示：在釉質(zhì)的硬度比較上，僅口腔黏膜4周組的釉質(zhì)硬度和正常鼠牙比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在釉質(zhì)的彈性模量比較上，腎包膜下3周后的移植物釉質(zhì)彈性模量比正常鼠牙略低，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，腎包膜下4周和口腔黏膜下4周后的移植物釉質(zhì)彈性模量均低于正常鼠牙組和腎包膜3周的釉質(zhì)彈性模量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但是這兩組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組間牙本質(zhì)的硬度及彈性模量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

Figure 5.The results of hardness test about enamel and dentin. Mean±SD. n=3. # P<0.05 vs normal mouse tooth.

Figure 6.The results of elastic modulus test about enamel and dentin. Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs normal mouse tooth; ##P<0.01 vs K-3wks.

4 拉曼光譜分析

選取拉曼光譜測(cè)試分析的實(shí)驗(yàn)組有正常鼠牙、腎包膜3周組、腎包膜4周組、口腔黏膜3周組和口腔黏膜4周組。結(jié)果顯示：各組的拉曼光譜趨勢(shì)基本一致，在961 cm-1處有最大峰值，但是在2 947 cm-1處，口腔黏膜3周組有明顯的峰值，遠(yuǎn)高于其它各組，見(jiàn)圖7。

Figure 7.The results of Raman spectroscopy tests. Each group of the Raman spectra went consistent. They all had the largest peak at 961 cm-1, but in 2 947 cm-1, the group of K-3wks had an obvious peak, which was far higher than other groups.

討 論

腎包膜下環(huán)境移植后因運(yùn)動(dòng)少，能給移植物提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的生物環(huán)境，在這一環(huán)境下，移植物能保持較好的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特性，而腎動(dòng)脈分支形成血管球，分布于腎小球內(nèi)，故血供相對(duì)豐富，可提供腎包膜內(nèi)移植物生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)，相對(duì)來(lái)說(shuō)移植物發(fā)育不會(huì)延遲?？谇活a黏膜由上皮及結(jié)締組織所構(gòu)成，并由基底膜所分隔，固有層結(jié)締組織較致密，黏膜下層較厚，脂肪較多，頰黏膜借黏膜下層附著于頰肌上，有一定張力，相對(duì)于腎包膜，口腔頰黏膜中血供沒(méi)那么豐富，且口腔黏膜在受到刺激時(shí)容易引起炎癥反應(yīng)，血管收縮，影響頰黏膜的微循環(huán)，造成低氧的微環(huán)境[7-8]，這可能是導(dǎo)致口腔黏膜環(huán)境與腎包膜環(huán)境差異的一個(gè)因素。

當(dāng)牙冠發(fā)育完成時(shí)，牙根即開始形成。研究表明，與牙根發(fā)育相關(guān)的組織有：上皮根鞘(Hertvig’s epithelial root sheath, HERS)、牙囊(dental follicle, DF)以及牙乳頭(dental papilla, DP)，這3種組織對(duì)于構(gòu)建完整的牙根-牙周復(fù)合體是必須的，被稱作發(fā)育期根端復(fù)合體(developing apical complex, DAC)[9]。DF可為牙根的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)，最終發(fā)育成牙根部的組織結(jié)構(gòu)[10]，其不僅在支持牙齒萌出方面有著重要的作用，還對(duì)牙根向正確的方向生長(zhǎng)有引導(dǎo)作用[11]。DP內(nèi)多是由未分化的間充質(zhì)細(xì)胞所構(gòu)成，故其在一定程度上顯示出干細(xì)胞特性，能夠持續(xù)地為牙根的生長(zhǎng)提供新生的細(xì)胞[12]。在這3種組織中，HERS對(duì)牙根的發(fā)育尤其重要，相關(guān)研究認(rèn)為，頸環(huán)形成HERS是牙根發(fā)育的先決條件，HERS的形成是牙根發(fā)育啟動(dòng)的組織學(xué)標(biāo)志，當(dāng)HERS形成后，牙根的發(fā)育是獨(dú)立的[13]。另外，諸多信號(hào)分子也參與到牙根發(fā)育的調(diào)控機(jī)制上來(lái)[14-16]。

腎包膜和口腔黏膜這兩個(gè)環(huán)境與牙槽骨環(huán)境有一定的區(qū)別，在這兩個(gè)環(huán)境中，沒(méi)有牙齒萌出的過(guò)程，故在以往的研究中，大多數(shù)腎包膜環(huán)境下都不能看到成型的牙根，即便有一定的發(fā)育，也是不完善的。在本實(shí)驗(yàn)中，極少數(shù)腎包膜下移植3周后的牙胚有類似牙根形成，而口腔黏膜下移植后所生成的牙齒均未出現(xiàn)牙根形成。分析可能原因如下：(1)可能是由于牙根的發(fā)育信號(hào)還未啟動(dòng)；(2)某種環(huán)境下破壞了牙胚的DAC，致使其中某一部分細(xì)胞不能正常分化而影響牙根形成；(3) 牙冠在密閉的環(huán)境中無(wú)法萌出，使牙根的生長(zhǎng)發(fā)育受限；(4) 剔除牙胚時(shí)破壞了帽狀期頸環(huán)的生長(zhǎng)環(huán)境，使各種發(fā)育信號(hào)傳導(dǎo)受阻或不能傳導(dǎo)；(5)某種環(huán)境下抑制了牙根表達(dá)的某種重要因子，從而使牙根不能正常萌出或萌出滯后。

腎包膜環(huán)境可以支持牙齒的形成，但是，在形成的牙齒結(jié)構(gòu)中，未檢測(cè)到有神經(jīng)的生成，神經(jīng)除了有感知作用外，其分泌的營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)牙齒的生命活力也有重要的影響，所以，在牙齒發(fā)育成型后，由于缺乏相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)因子維系，在某些特性方面可能會(huì)有所改變，從而影響了彈性和硬度。但是，這只是本研究得到的初步結(jié)論，該結(jié)論的準(zhǔn)確性還需要進(jìn)一步的探索，用更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)原理加以驗(yàn)證。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從發(fā)育角度，比對(duì)了牙胚在不同環(huán)境下發(fā)育的組織學(xué)特點(diǎn)、物理學(xué)特性及化學(xué)組分，結(jié)果表明牙胚移植至腎包膜及口腔黏膜下均能進(jìn)一步發(fā)育礦化形成牙齒樣結(jié)構(gòu)，盡管在口腔黏膜環(huán)境下形成牙齒的諸多性狀與腎包膜環(huán)境(非口腔環(huán)境)下發(fā)育的牙齒相比有差異，但口腔黏膜環(huán)境對(duì)牙胚的生長(zhǎng)發(fā)育還是具有一定的影響。當(dāng)然，如何進(jìn)一步優(yōu)化和開發(fā)適合牙齒發(fā)育的口腔環(huán)境，為將來(lái)臨床牙齒再生技術(shù)探尋較為理想的培養(yǎng)環(huán)境，也需進(jìn)一步探索和研究。

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Comparative development of mouse tooth germs transplanted in subrenal capsule and oral submucosa

HE Ying1, LIU Peng-fei2, LIU Xiao1, PIAO Zheng-gen1, CAI Jing-lei3

(1DepartmentofStomatology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofRegenerationMedicine,SchoolofPharmaceuticalScience,JilinUniversity,Changchun130021,China;3KeyLaboratoryofRegene-rativeBiology,GuangzhouInstitutesofBiomedicineandHealth,ChineseAcademyofSciences,Guangzhou510530,China.E-mail:pzg430@126.com；cai_jinglei@gibh.ac.cn)

AIM: To compare 2 environments， the subrenal capsule and oral submucosa, for producing well-formed teeth from mouse tooth germs and for exploring the ideal environment for tooth regeneration. METHODS: Two groups were set up. Group A was transplanted with the mouse embronic day (ED) 14.5 first mandibular molar tooth germs into the subrenal capsule, while group B was transplanted with the ED14.5 first mandibular molar tooth germs into the oral submucosa. After 3 weeks and 4 weeks, the host mice were sacrificed, and the transplanted explants were evaluated with morphologic observation, histological structures, hardness and elastictic modulus tests, and chemical compositions. RESULTS: (1) The explants isolated from both environments showed the tooth-like structures, but as to the group B, the crown was smaller, and the shape of the cusps was not significant. (2) HE staining showed that the dentin and enamel in group A were thicker than those in group B in which the ameloblasts and odontoblasts were differentiated not very well. (3) In the test of enamel hardness, only the hardness of 4 weeks in group B was lower than normal mouse tooth. In the test of enamel modulus, the elastic modulus of enamel in 3 weeks of group A was slightly lower than normal mouse tooth, but the difference was not significant.The elastic modulus of enamel in 4 weeks of group A and group B was significantly lower than normal mouse tooth and 3 weeks of group B. The hardness and elastic modulus of dentin in 3 groups was not significant. (4) Raman spectroscopy showed 2 groups grew in harmony in general, they all had the largest peak in the point of 961 cm-1, but the 3 weeks of group B had an obvious peak in the point of 2 947 cm-1. CONCLUSION: For the development of ED14.5 tooth germs, we obtain almost the whole tooth in subrenal capsule transplantation after 3 or 4 weeks. The buccal submucosa environment still has a certain influence on the tooth germ development, although there are some differences about the tooth development between this environment and subrenal capsule environment.

Tissue engineering; Tooth germ; Renal capsule; Oral mucosa; Transplantation

1000- 4718(2015)01- 0141- 07

2014- 06- 20

2014- 12- 01

中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院再生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題資助項(xiàng)目(No. KLRB201217)

△通訊作者 樸正根 Tel: 020-85220266; E-mail: pzg430@126.com; 蔡景蕾 Tel: 020-32015236; E-mail: cai_jinglei@gibh.ac.cn

R78； Q813

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.027