亞溶量C5b-9可誘導(dǎo)足細(xì)胞的保護(hù)性自噬應(yīng)答*

呂倩影， 周建華， 楊鳳杰， 蒲金赟， 張 瑜

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科，湖北 武漢 430030)

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亞溶量C5b-9可誘導(dǎo)足細(xì)胞的保護(hù)性自噬應(yīng)答*

呂倩影， 周建華， 楊鳳杰， 蒲金赟， 張 瑜△

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科，湖北 武漢 430030)

目的： 通過亞溶量補(bǔ)體C5b-9(sC5b-9)攻擊足細(xì)胞的離體模型，探討自噬在免疫介導(dǎo)足細(xì)胞損傷過程中的作用。方法: 建立sC5b-9攻擊足細(xì)胞體外模型，采用單丹磺酰尸胺(MDC)染色標(biāo)記自噬泡，瑞氏-吉姆薩染色光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫熒光檢測nephrin的表達(dá)及分布，Western blotting檢測LC3-II和LC3-I的表達(dá)，MTT法檢測細(xì)胞存活率，Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果: 成功建立sC5b-9攻擊足細(xì)胞體外模型，將細(xì)胞溶破率≤5%定義為亞溶量攻擊。MDC染色和自噬標(biāo)志LC3-II的檢測均顯示造模后48 h足細(xì)胞的自噬活動明顯活躍。抑制自噬可明顯加重sC5b-9所致的足細(xì)胞形態(tài)異常。sC5b-9攻擊可使足細(xì)胞nephrin的表達(dá)量明顯減少，并且異常分布，而抑制自噬可進(jìn)一步下調(diào)nephrin的表達(dá)。抑制自噬可促進(jìn)sC5b-9所誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。結(jié)論: sC5b-9可直接誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬活動增強(qiáng)，而自噬則在sC5b-9介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮著保護(hù)作用。

自噬； 足細(xì)胞； 亞溶量C5b-9

足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過膜的重要屏障，常常遭受細(xì)菌毒素、炎癥因子、免疫復(fù)合物、病理代謝產(chǎn)物等多種損傷性打擊，其作為一種高度分化細(xì)胞，在體內(nèi)分裂增殖能力有限，一旦受損很難通過再生修復(fù)。近年研究表明，足細(xì)胞損傷和缺失是慢性腎臟病進(jìn)展的主要決定因素之一[1-2]。因此，對足細(xì)胞修復(fù)機(jī)制的探討可能為延緩腎小球疾病的進(jìn)展提供新的突破口。以往，我們對大鼠被動Heymann腎炎(passive Heymann nephritis, PHN)模型的研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)增強(qiáng)自噬可減少PHN大鼠的足細(xì)胞凋亡，減輕腎臟病變和蛋白尿程度，提示在此病變過程中自噬可能發(fā)揮保護(hù)性作用[3]。本研究通過建立亞溶量補(bǔ)體C5b-9(sublytic C5b-9, sC5b-9)攻擊足細(xì)胞的離體模型，從細(xì)胞水平觀察自噬在sC5b-9介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷過程中的作用。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞培養(yǎng)、sC5b-9攻擊足細(xì)胞模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞系MPC5(Peter Mundel 教授惠贈，北京大學(xué)第一醫(yī)院丁潔教授轉(zhuǎn)贈)。以含有10% FBS、1×105U/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。33 ℃下，加入小鼠重組IFN-γ(PeproTech)維持細(xì)胞增殖傳代，37 ℃下，去IFN-γ培養(yǎng)14 d誘導(dǎo)其分化。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用分化態(tài)足細(xì)胞。

sC5b-9攻擊模型的建立：參照文獻(xiàn)[4]的方法制備兔抗MPC5細(xì)胞多克隆抗體。以正常人血清作為補(bǔ)體源，建立sC5b-9攻擊足細(xì)胞體外模型，取分化態(tài)MPC5細(xì)胞，無血清RPMI-1640培養(yǎng)基潤洗2次，以兔抗MPC5細(xì)胞多克隆抗體(1∶50)致敏足細(xì)胞，37 ℃孵育1 h，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2次，加入不同稀釋比例的正常人血清(normal human serum，NHS)，37 ℃孵育1 h，收集培養(yǎng)上清，測定其中LDH含量以確定細(xì)胞溶破率，將溶破率≤5%定義為亞溶量攻擊。以滅活補(bǔ)體的NHS作對照。

實(shí)驗(yàn)分空白對照(control)組、補(bǔ)體滅活(complement inactivation，complement-I)組、sC5b-9組和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenosine,3-MA)組。其中，補(bǔ)體滅活組和sC5b-9組，是指在兔抗MPC5細(xì)胞多克隆抗體致敏足細(xì)胞后分別予滅活補(bǔ)體的NHS和亞溶量的NHS干預(yù)；而3-MA組，則指在制備sC5b-9攻擊模型前以自噬抑制劑3-MA 5 mmol/L(Sigma)預(yù)處理1 h。

2 主要實(shí)驗(yàn)方法

2.1 單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)染色標(biāo)記自噬泡 各組足細(xì)胞棄培養(yǎng)液后，以無血清RPMI-1640稀釋的MDC(0.05 mmol/L，Sigma)37 ℃孵育10 min，PBS洗滌3次，立即于激光共聚焦顯微鏡下觀察、攝像。

2.2 Western blotting檢測 各組足細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌，裂解液裂解，離心取上清，熱變性處理，以考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。等量蛋白樣品(30 μg)以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，加Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，PBST洗滌后，加HRP標(biāo)記Ⅱ抗室溫孵育1 h，PBST洗膜，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，用UVP-2000凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。以GAPDH為內(nèi)參照。Ⅰ抗包括兔抗鼠LC3(Cell Signaling)和兔抗鼠GAPDH(武漢谷歌公司)。

2.3 瑞氏-吉姆薩染色 取出各組足細(xì)胞爬片，PBS洗滌2次，95%乙醇室溫固定30 min，0.05%瑞氏-吉姆薩復(fù)合染液孵育10 min，沖洗晾干，置于清潔載玻片上，光學(xué)顯微鏡下觀察、攝像。

2.4 細(xì)胞免疫熒光染色 取各組足細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，0.25% Triton X-100 PBS冰上破膜5 min，PBS洗滌，5% BSA封閉30 min，滴加Ⅰ抗：兔抗小鼠nephrin抗體，4 ℃濕盒內(nèi)孵育過夜，PBS洗滌，滴加FITC標(biāo)記的Ⅱ抗，于濕盒內(nèi)37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌，50%緩沖甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察、攝像。

2.5 MTT實(shí)驗(yàn) 向96孔板中的各組足細(xì)胞，每孔滴加MTT溶液(5 g/L，Sigma)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測定吸光度(A490)值，每組設(shè)3個復(fù)孔計(jì)取平均值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2.6 細(xì)胞凋亡檢測 胰酶消化收集各組足細(xì)胞，PBS重懸制備單細(xì)胞懸液，PBS洗滌2次，加500 μL binding buffer重懸細(xì)胞，加5 μL Annexin V-FITC混勻，加5 μL PI混勻，室溫下避光孵育10 min，立即上流式細(xì)胞儀檢測。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 成功建立sC5b-9攻擊足細(xì)胞的體外模型

如圖1所示，在足量兔抗小鼠足細(xì)胞抗血清致敏的基礎(chǔ)上，以不同稀釋倍數(shù)的NHS孵育足細(xì)胞，當(dāng)1∶160稀釋時測得足細(xì)胞溶破率為7.2%，減去靜息溶破率2.5%，得到矯正的足細(xì)胞溶破率4.7%。因此，本研究中以1∶160稀釋的NHS構(gòu)建sCb-9攻擊足細(xì)胞的體外模型。

Figure 1.The lysis rate of antibody-sensitized podocytes incubated with different dilution of NHS. Mean±SD. n=3.

2 sC5b-9可誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬

MDC染色顯示，sC5b-9干預(yù)后48 h足細(xì)胞內(nèi)的嗜酸性囊泡數(shù)量明顯增多(圖2A)；同時，足細(xì)胞LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯增高，而補(bǔ)體滅活組和空白對照組之間無顯著差異(圖2B)。

Figure 2.Evaluation of autophagy in differentiated conditionally immortalized murine podocytes. A: autophagic vacuoles detected by MDC staining (×1 000)； B: examination of LC3 protein level by Western blotting. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs complement -I group.

3 抑制自噬明顯加重sC5b-9所致的足細(xì)胞形態(tài)異常

sC5b-9干預(yù)后48 h足細(xì)胞呈現(xiàn)異常形態(tài)，表現(xiàn)為胞體回縮，細(xì)胞呈細(xì)長形，胞漿面積減少，胞膜皺褶增多，足突形成減少，失去典型的“樹枝狀”表型，出現(xiàn)板狀偽足，細(xì)胞間連接減少。以3-MA預(yù)處理抑制自噬，可使上述病變顯著加重，見圖3。

Figure 3.Cell morphology of differentiated conditionally immortalized murine podocytes (Wright-Giemsa staining, ×400).

4 抑制自噬進(jìn)一步加重足細(xì)胞裂孔膜病變

造模后48 h，與補(bǔ)體滅活組相比，sC5b-9組足細(xì)胞裂孔膜蛋白nephrin表達(dá)明顯下調(diào)，并呈現(xiàn)沿核周聚集的異常分布；與sC5b-9組相比，給予3-MA預(yù)處理抑制自噬，可使足細(xì)胞nephrin的表達(dá)量進(jìn)一步減少，見圖4。

Figure 4.Nephrin expression in differentiated conditionally immortalized murine podocytes (immunofluorescence staining, ×400).

5 抑制自噬可促進(jìn)sC5b-9所誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡

如圖5所示，sC5b-9干預(yù)后48h足細(xì)胞的生存率明顯下降，同時，AnnexinⅤ/PI染色結(jié)果顯示，sC5b-9組足細(xì)胞凋亡率較補(bǔ)體滅活組增高；與sC5b-9組相比，給予3-MA預(yù)處理抑制自噬，可使足細(xì)胞生存率進(jìn)一步減低，凋亡率顯著增高。

Figure 5.Survival rate and early apoptotic rate of the podoctes. A: podocyte viability was measured by MTT； B: podocyte apoptosis was measured by Annexin V/PI staining. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs complement-I group; △P<0.05 vs sC5b-9 group.

討 論

膜性腎病(membranous nephropathy, MN)是一類非炎癥性、器官特異性的自身免疫病，約30%的患者可出現(xiàn)嚴(yán)重的腎功能受損，而現(xiàn)有的免疫抑制治療療效十分有限，因此，需要深入探究其進(jìn)展和修復(fù)機(jī)制，以尋找新的治療靶點(diǎn)。雖然，在過去的十年中，隨著一系列抗原成分和易感基因的發(fā)現(xiàn)，人們對于MN分子機(jī)制的認(rèn)識有了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，但迄今為止其復(fù)雜的免疫發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明[5]。以往研究已證實(shí)sC5b-9攻擊足細(xì)胞是導(dǎo)致MN發(fā)生的核心環(huán)節(jié)[6]。sC5b-9攻擊可激活一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如蛋白激酶、磷脂酶、活性氧自由基、轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、蛋白酶、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路等等，最終這些信號將影響細(xì)胞代謝、脂質(zhì)和細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)及功能、裂孔膜形成等足細(xì)胞生物學(xué)行為[7]。正如本研究所示，sC5b-9可直接導(dǎo)致離體培養(yǎng)的足細(xì)胞失去典型的“樹枝狀”表型，而呈現(xiàn)胞體細(xì)長、胞膜皺縮、板狀偽足等異常形態(tài)，同時伴有足突減少以及裂孔膜蛋白nephrin的表達(dá)下調(diào)和分布異常。

足細(xì)胞是一類類似于神經(jīng)元的高度分化細(xì)胞，其外部形態(tài)呈多突狀，由胞體、主突起和足突三部分構(gòu)成：漂浮在腎小球Bowman’s的巨大胞體上，向腎小球毛細(xì)血管袢伸出長的主突起，而主突起則通過其分出的足突黏附于腎小球基底膜；相鄰的足突規(guī)則有序地相嵌形成指狀交叉，其間由裂孔膜橋接，后者完全覆蓋足突間25～55 nm的濾過間隙，構(gòu)成腎小球?yàn)V過的最后一道屏障。因此，足細(xì)胞時常面臨免疫攻擊、血流動力學(xué)異常、蛋白尿、藥物、感染等諸多損傷因素的干擾，然而作為一種終末分化細(xì)胞，在體內(nèi)其不能以有絲分裂的方式有效應(yīng)對損傷，故而當(dāng)損傷性刺激超過了足細(xì)胞自我防御能力時，將出現(xiàn)足細(xì)胞丟失，如若細(xì)胞數(shù)目減少10～20%，將導(dǎo)致基底膜裸露及腎小球硬化[8]。凋亡是腎小球足細(xì)胞丟失的主要途徑。與以往研究[9]相符，本研究也觀察到sC5b-9可直接誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，在干預(yù)后48 h，離體培養(yǎng)的足細(xì)胞生存率明顯下降，凋亡率明顯升高。

sC5b-9在激活多條損傷信號通路導(dǎo)致足細(xì)胞病變的同時，往往也激活一系列防御機(jī)制以限制損傷、促進(jìn)修復(fù)。作為長壽命細(xì)胞，“形成自噬體，清除多余或受損的蛋白質(zhì)及細(xì)胞器”是足細(xì)胞賴以生存的至關(guān)重要的損傷應(yīng)答機(jī)制[10]。自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞的一種溶酶體依賴的降解途徑，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)廢棄的長壽命蛋白及細(xì)胞器的降解，使降解產(chǎn)物被細(xì)胞再利用，因此，其在細(xì)胞發(fā)育、損傷修復(fù)、組織重塑及適應(yīng)性應(yīng)答等方面發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用。哺乳動物細(xì)胞的自噬反應(yīng)可分為巨自噬、微自噬、分子伴侶介導(dǎo)的自噬3種，其中巨自噬即通常所指的自噬，其所介導(dǎo)的批量降解是一個嚴(yán)格調(diào)控的程序性過程。首先，在胞漿中形成一個來源于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體的扁平雙層膜結(jié)構(gòu)，而后不斷擴(kuò)張，稱之為“前自噬泡”；前自噬泡不斷延伸，將胞漿中廢棄組分?jǐn)埲肫渲校筮吘壢诤?，形成密閉的球形雙層膜結(jié)構(gòu)，稱之為“自噬體”；隨后，在細(xì)胞骨架蛋白驅(qū)動下自噬體與溶酶體融合，形成“自噬溶酶體”，以降解其內(nèi)容物及雙層膜結(jié)構(gòu)[11]。多數(shù)情況下，自噬作為細(xì)胞自我修復(fù)和對抗死亡的一種保護(hù)性應(yīng)答反應(yīng)而存在[12-14]。本研究觀察到，以3-MA抑制自噬不僅可明顯加重sC5b-9所致的足細(xì)胞形態(tài)異常，使裂孔膜蛋白nephrin的表達(dá)進(jìn)一步下降，而且還可促進(jìn)sC5b-9所誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。

綜上所述，我們認(rèn)為，sC5b-9作為損傷因素在致足細(xì)胞病變的過程中，同時也誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)，而自噬在此過程中發(fā)揮著重要的保護(hù)性作用。本研究提示增強(qiáng)自噬有望成為治療免疫介導(dǎo)性足細(xì)胞病變的措施之一。

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Sublytic C5b-9 induces protective autophagy in cultured podocytes

Lü Qian-ying, ZHOU Jian-hua, YANG Feng-jie, PU Jin-yun, ZHANG Yu

(DepartmentofPediatrics,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:yuzhang497@163.com)

AIM: In podocytes, autophagy occurs at a high basal level and dysregulated autophagy is associa-ted with a variety of podocytopathies. This paper is to investigate the role of autophagy in sublytic C5b-9-induced podocyte injury. METHODS: Sublytic complement C5b-9 stimulation was used as aninvitromodel. Autophagosomes were confirmed using monodansylcadaverine (MDC) staining. Immunoblotting was used to measure the change of autophagy-related markers. Cellular morphological changes were observed by Wright-Giemsa staining. Immunofluorescence staining and confocal microscopy were used to detect the expression and distribution of nephrin. The cell viability was assessed by methylthiazol tetrazolium (MTT) assay. The cell apoptosis was assessed by Annexin V-fluorescein isothiocyanate/PI staining. RESULTS: For ensuring sublytic complement injury, the maximal amounts of anti-podocyte antiserum and 160×-diluted normal human serum were used without inducing cell lysis (defined as >5% LDH release). Sublytic C5b-9 promoted autophagy of podocytesinvitro. The proautophagic effect of sublytic C5b-9 manifested in the form of accumulated MDC-labeled vesicles and enhanced the expression of LC3-Ⅱ. Autophagy inhibitor 3-methyladenosine (3-MA) promoted sublytic C5b-9-induced podocyte morphological abnormalities. Compared with the sublytic C5b-9-injured podocytes, 3-MA exposure further decreased the expression of nephrin. 3-MA enhanced sublytic C5b-9-induced podocyte apoptosis. CONCLUSION: Sublytic C5b-9 attack induces autophagy, which may play a protective role against complement-mediated podocyte injury.

Autophagy; Podocytes; Sublytic C5b-9

1000- 4718(2015)01- 0059- 05

2014- 06- 17

2014- 11- 05

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81100514)； 教育部博士點(diǎn)基金(新教師類)(No. 20110142120017)； 華中科技大學(xué)自主創(chuàng)新研究基金(No. 2013QN192)

△通訊作者 Tel： 027-83663297； E-mail: yuzhang497@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.012