細菌耐藥性檢測方法的研究進展

馬秀清，陳良安

解放軍總醫(yī)院 呼吸科，北京 100853

細菌耐藥性檢測方法的研究進展

馬秀清，陳良安

解放軍總醫(yī)院 呼吸科，北京 100853

明確致病菌的耐藥特性是指導各種細菌感染性疾病治療的關鍵。常規(guī)藥敏試驗需要從標本中分離出菌株，操作煩瑣、費時。近年來，一些分子生物學技術在細菌耐藥性檢測領域取得了很大進步，但臨床應用方面還有待改善。本文重點介紹幾種技術在細菌耐藥性檢測中的新進展，為臨床實現細菌耐藥性的快速準確檢測提供參考。

細菌；抗藥性；藥敏試驗

隨著抗生素的使用，耐藥菌不斷出現，特別是“超級耐藥菌”的報道引起了全世界對細菌耐藥性問題的關注。因此，謹慎合理地使用抗生素顯得尤為重要?？焖贉蚀_的檢測致病菌耐藥性是指導合理使用抗生素的關鍵。常規(guī)的藥敏試驗需要從臨床標本中分離出菌株，耗費時間長，且許多生長慢或不容易培養(yǎng)的細菌不能通過藥敏試驗進行耐藥性檢測。近年來，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)、基因芯片、飛行時間質譜、微流體芯片、全基因組測序等技術在快速檢測細菌耐藥性方面迅速發(fā)展。本文就幾種技術在快速檢測細菌耐藥性方面的新進展進行綜述。

1 藥敏試驗

藥敏試驗是目前各實驗室檢測細菌耐藥性的常規(guī)方法[1]，主要包括肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法、K-B紙片法、E-test實驗及各種自動化藥敏分析系統，如Vitek系統、MicroScan WalkAway系統、Phoenix Automated Microbiology系統等。魏丹丹等[2]采用Vitek 2 Compact和MicroScan Walk Away 40 SI全自動微生物鑒定儀檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)的靈敏度為95.45%和93.18%，特異度為94.12%和92.68%，符合率為94.87%和92.94%，提示兩種系統均可用于MRSA的檢測，但前提是需要分離臨床菌株。藥敏試驗的優(yōu)點：有國際化的標準操作流程[3]，敏感性高，肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法和E-test試驗能夠檢測藥物的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，指導用藥劑量，每種方法均有相應的試劑盒減輕了操作者的負擔。缺點：不能直接檢測臨床標本，需要培養(yǎng)才能鑒定出耐藥菌株，培養(yǎng)受限的菌株無法進行藥敏試驗?？梢?，藥敏試驗不能完全滿足臨床的需求。

2 PCR技術

以PCR為基礎的技術包括普通PCR和實時熒光定量PCR(Real-time PCR)，其原理都是基于目的基因特異片段的擴增。由于每種細菌均有自己的特異基因或片段，所以最初PCR用于菌種的鑒定和定量分析。隨著細菌耐藥機制研究的進展，PCR也應用于細菌耐藥基因的檢測中。首先，最具影響力的是采用PCR方法檢測金黃色葡萄球菌中mecA基因的表達，從而篩選出MRSA。目前，利用普通PCR或Real-time PCR檢測mecA基因及其相關片段的商業(yè)化檢測系統已經產生，如BD公司的GeneOhm系統[4]和Cepheid公司的GeneXpert系統[5]，均能在數小時內完成對標本的檢測。Dalpke等[6]共收集734例鼻拭子、30例肛周拭子和26例外科感染傷口拭子，采用BD Max MRSA全自動檢測儀，從標本處理到出結果，共耗時約150 min，靈敏度和特異度分別為93.9%和99.2%。在PCR方法與傳統藥敏方法比較的研究中顯示[7]，PCR使患者得到最佳抗生素治療的時間縮短了25.4 h。一個多中心報道也提示，GeneXpert系統的靈敏度超過了93%，適合臨床應用[4]。PCR技術在耐萬古霉素腸球菌的耐藥基因vanA和vanB的檢測中也有應用，但vanB的假陽性比較高，特異性差[8]。PCR技術檢測革蘭陰性菌中耐藥基因的報道也很多，例如多重real time PCR法檢測碳青霉烯類的耐藥基因KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48[9]，多重TaqMan PCR法檢測質粒介導的AmpC類β-內酰胺酶基因[10]等。

另外，利用Real-time PCR能夠定量檢測目的基因拷貝數的優(yōu)勢，檢測細菌在抗生素環(huán)境中的生長情況，可縮短培養(yǎng)時間，這是PCR技術在耐藥基因檢測中應用的一個新思路。ompA基因在鮑曼不動桿菌中呈恒定表達，能反應鮑曼不動桿菌的生長情況。有報道[11]通過Real-time PCR分別監(jiān)測多黏菌素、環(huán)丙沙星和亞胺培南環(huán)境中，兩株鮑曼不動桿菌ompA基因的拷貝數，成功地鑒別出了敏感株和耐藥株。該方法雖然也進行了培養(yǎng)，但實時熒光定量PCR檢測所需樣品量少，較傳統藥敏試驗時間短。因此，PCR技術在細菌耐藥基因檢測的應用中具有快速、靈敏度高的優(yōu)勢，但1次PCR檢測的耐藥基因數目非常有限。

3 基因芯片技術

基因芯片技術是一種高通量自動化檢測技術，其基本原理是將一組已知序列的核酸探針固定在基片上，與未知序列進行雜交，從而達到檢測目的，可檢測到10 ～ 100個DNA的拷貝數。基因芯片在病原微生物分子診斷方面可用于病原體菌種鑒定、分型、診斷、耐藥基因檢測等多個領域，一直是研究的熱點。在具體操作中，有的將標本全基因組DNA進行隨機引物擴增，標記上Cy3熒光染料，與芯片雜交，然后用儀器進行分析，但熒光染料和儀器價格昂貴，分析復雜[12]；有的將PCR和芯片技術相結合，先利用標記的引物擴增出標本DNA特異的目的片段，再與芯片反應，分析結果，適合耐藥基因的檢測[13]。

近年來，基因芯片技術在細菌耐藥基因檢測的應用中，也有新的改進，尤其在芯片的試驗步驟、信號采集和分析方法等環(huán)節(jié)進行了各種改進，簡化了操作，降低了成本。Naas等[14]利用多重結扎介導PCR技術(multiplex ligation detection reaction，LDR)，一對引物便可擴增出所有的特異片段，然后標記上生物素，與芯片雜交，結果的判讀也很方便。該團隊對研制的芯片進行不斷升級[15-16]，在最新的升級版芯片中可一次性檢測超廣譜β內酰胺類耐藥基因TEM、SHV、CTX-M，質粒介導的頭孢菌素類耐藥基因CMY-2-like、DHA、FOX、ACC-1、ACT/MIR、CMY-1-like/MOX，碳青霉烯類耐藥基因KPC、OXA-48、VIM、IMP、NDM，經臨床菌株驗證顯示，敏感性和特異性均為100%，但還沒有直接應用于臨床標本。在耐藥基因檢測方面也有相關的試劑盒通過了FDA批準，如Curetis公司的UnyveroTMP50試劑盒[17]，敏感性為55% ～ 100%，特異性為72.3% ～ 100%。該試劑盒采用了多重PCR擴增標本中目的片段，4 h出結果，能檢測22種耐藥基因，包括β內酰胺類、氟奎諾酮類和1類整合子耐藥基因。

在我國，軍事醫(yī)學科學院研發(fā)了一種利用新型納米金標底物信號放大技術代替?zhèn)鹘y的熒光標記技術[13]。其原理是將下游引物標記生物素，經多重PCR與芯片雜交后，洗去未結合的帶生物素標記的引物片段，再與連有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的親和素分子結合，HRP可催化酪胺分子大量沉積在其表面，起到級聯放大的作用，將靈敏度提高10 ～ 100倍，結果肉眼可見，形成可視化基因芯片，無需信號采集和分析儀器，很大程度上降低了成本，非常適合臨床體外診斷。對于難培養(yǎng)的結核分枝桿菌，我國國家食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)批準了北京博奧生物有限公司生產的結核分枝桿菌耐多藥基因芯片檢測試劑盒，其原理基于katG、inhA和rpoB基因突變導致對利福平和異煙肼多藥耐藥的機制，分離株或痰標本均可檢測，6 h內出結果[18]，而傳統的培養(yǎng)方法需要4 ～ 6周，該試劑盒極大縮短了檢測時間，有利于指導臨床用藥。

4 飛行時間質譜

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)是一種新型的軟電離生物質譜。其原理是先將生物分子電離，離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同形成蛋白質指紋譜，然后經軟件與數據庫中標準指紋圖譜進行對比，即可確定所檢微生物的類型，具有靈敏度高、準確、快速的優(yōu)勢。

MALDI-TOF MS技術主要應用于菌種的鑒定，而在致病菌耐藥性方面的檢測還有爭議。Edwards-Jones等[19]曾利用MALDI-TOF MS技術成功分辨出甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌和甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(methicillin sensitive staphylococcus aureus，MSSA)。但2013年證實該技術能夠區(qū)分MRSA和MSSA，不是因為敏感和耐藥的區(qū)別，而是由于金葡菌克隆譜系的不同[20]。因此該技術不能直接用來鑒定MRSA和MSSA。如何將MALDI-TOF MS技術成功應用于致病菌的耐藥性檢測呢？Hrabak等[21]利用耐藥菌株水解抗生素產生的產物來反映菌株的耐藥性，在124株腸桿菌和銅綠假單胞菌中，利用MALDI-TOF MS技術檢測美羅培南的水解產物，準確地反應了碳青霉烯酶的活性，敏感性和特異性分別為96.67%和97.87%。Hrabak等[22]也利用該方法通過抗生素水解產物指紋譜峰值的不同，成功地檢測到了腸桿菌中VIM-1、KPC、OXA-48和OXA-162耐藥基因和鮑曼不動桿菌中NDM1耐藥基因。雖然MALDITOF MS技術在致病菌耐藥性方面的研究取得了一定的進展，但該技術影響因素很多，需要制定標準的操作流程，此外標準指紋譜庫還有待完善。

5 微流體芯片

微流體芯片是隨著微電子、微機械、生物工程和納米技術的發(fā)展而產生的，可以在幾平方厘米的芯片上完成分子生物所涉及的樣品處理、反應、檢測等復雜的操作，實現常規(guī)實驗室的各種功能，所以又稱為芯片實驗室。Choi等[23]在含有瓊脂糖的微流體裝置中，顯微鏡追蹤觀察單個細胞在抗生素下的生長情況，比傳統的藥敏試驗時間短，3 ～4 h就可以提供MIC值。該方法還在不斷地改進中，如通過抗生素下細菌代謝產物pH值的變化來檢測細菌的生長[24]，通過熒光染色觀察抗生素下細菌的生長情況[25]。目前有報道微流體芯片可直接檢測患者尿液標本，3.5 h內出結果，與傳統藥敏試驗相比，有94%的符合率[26]。但還沒有直接檢測臨床其他類型標本的研究。微流體芯片由于體積微小，所以具有快速、高通量、低消耗的優(yōu)點，但也是由于體積微小很容易受一些因素干擾，如靜電、pH值、溫度等。另外微流體芯片需要輔助操作設施，價格昂貴，需要經過培訓的專業(yè)人員操作。該技術還處于早期實驗室研發(fā)階段。

6 全基因組測序

隨著人類基因組計劃的完成，全基因組測序也滲透到各個研究領域，包括細菌耐藥方面的研究。全基因組測序能夠提供檢測樣品的完整序列，通過數據庫分析可發(fā)現大量的信息，但價格貴，分析時間長，一直用于某些特殊菌株的測序。Zankari等[27]提出將全基因組測序應用于臨床常規(guī)檢測的觀點，并收集了200株菌，包含傷寒沙門桿菌、大腸埃希菌、糞腸球菌、屎腸球菌4個菌種，將所有菌株全基因組測序結果和藥敏試驗比較，符合率為99.74%，可見全基因組測序基本能正確反應細菌的耐藥性。在我國，朱健銘等[28]利用高通量測序技術對泛耐藥肺炎克雷伯菌JM 45株做了全基因組測序，得到該菌株1條完整的基因組序列及2條質粒序列，其中基因組序列中攜帶了耐藥基因gyrA和parC，與肺炎克雷伯菌喹諾酮類藥物敏感株比較，gyrA基因第83位密碼子TCC→ATC突變，parC基因第80位密碼子AGC→ATC突變，為該菌株耐藥機制的研究奠定了基礎。另外，全基因組測序在多藥耐藥菌株暴發(fā)流行時起到了重要的作用，如MRSA在美國多家醫(yī)院的暴發(fā)流行時，通過全基因組測序，比較金黃色葡萄球菌敏感株和耐藥株序列的差異，對耐藥株的耐藥機制進行了充分研究[29]；大腸埃希菌(E. coli O104：H4)在德國的暴發(fā)流行時，同樣是全基因組測序使人們更充分的認識到了E. coli O104：H4的耐藥機制[30]。因此在耐藥菌暴發(fā)初期，積極地進行耐藥菌全基因組測序是十分必要的。

7 結語

細菌耐藥性檢測主要包括藥敏試驗和耐藥基因檢測。由于藥敏試驗需要2 ～ 3 d出結果，這期間臨床醫(yī)生只能依靠經驗性治療。而以上幾種耐藥基因檢測方法以其較高的敏感性和特異性，可以在藥敏試驗結果出來前為臨床提供參考，減少經驗性治療，提高療效。但基因檢測方法也存在不足：1)PCR、基因芯片、飛行時間質譜和微流體芯片技術不能檢測到新的耐藥機制，可導致治療不足；2)PCR、基因芯片、飛行時間質譜和全基因組測定技術不能確定含有耐藥基因的菌株是否處于耐藥狀態(tài)，容易產生過度治療；3)PCR、基因芯片、飛行時間質譜和全基因組測定技術不能提供MIC值，無法指導臨床用藥劑量。目前我國雖然有很多細菌耐藥性檢測的基礎研究，也有些試劑盒經過了CFDA的批準，但檢測的范圍還十分局限，臨床應用仍然受限。因此，還需不斷努力探索更實用、更快速、更準確的細菌耐藥性檢測方法。

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Advances in detection of bacterial drug resistance

MA Xiuqing, CHEN Liang'an

Department of Respiratory Diseases, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

CHEN Liang'an. Email: chenliangan301@163.com

The detection of bacterial drug resistance is essential for guiding the treatment of many types of bacterial infections. The most commonly employed method is antimicrobial susceptibility testing. This method requires that the pathogens are isolated from the clinical samples before testing, and it is complicated and also takes time. In recent years, some molecular biology techniques have made great progress in the detection of bacterial drug resistance, but still need to be improved in clinical practice. This paper aims to highlight several techniques and provide references for rapid pathogen resistance detecting in clinical practice.

bacteria; drug resistance; drug sensitivity test

R 446.5

A

2095-5227(2015)04-0404-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.04.027

時間：2014-12-12 10:53

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20141212.1053.003.html

2014-09-16

北京市科技專項(Z121107002812029)

Supported by the Beijing Science and Technology Program(Z1211070028 12029)

馬秀清，女，碩士，主管技師。研究方向：肺炎致病菌的耐藥機制。

Email: mxq820812@163.com

陳良安，主任醫(yī)師，博士生導師。Email: chenliangan301 @163.com