吡非尼酮滴眼液在兔眼小梁切除術(shù)后抗瘢痕作用研究*

邵毅，余瑤，裴重剛，胡佩宏，楊璐，黃歆，涂萍

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 眼科，江西 南昌330006；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南昌第三醫(yī)院 內(nèi)分泌科，江西 南昌330009）

術(shù)后結(jié)膜傷口愈合不良是青光眼濾過術(shù)晚期失敗的主要原因[1]。有些疤痕體質(zhì)的患者，盡管使用高濃度的5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）或絲裂霉素C（mitomycin C，MMC）仍可能導(dǎo)致晚期濾過泡形成失敗[2]。青光眼濾過術(shù)后的傷口瘢痕問題，已成為眼科的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，因此，尋找安全、有效、副作用小的抗瘢痕藥物極為關(guān)鍵[3]。吡非尼酮（pirfenidone，PFD）是一種新型抗纖維化藥物，動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)已證明其具有抗纖維化的潛力[4]。PFD能下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor-β，TGF-β）及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）[5]，也可以清除活性氧，從而抑制組織修復(fù)[6]。在人視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞，PFD可以阻止TGF-β1誘導(dǎo)的纖連蛋白合成[7]。此外，PFD能抑制白介素-1誘導(dǎo)的金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metallopro teinases 1，TIMP1），增加甲狀腺相關(guān)眼病患者眼眶成纖維細(xì)胞的抗纖維化作用[8]。而本研究旨在探討PFD在兔小梁切除術(shù)后抑制結(jié)膜濾過泡瘢痕化的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 PFD滴眼液的制備

將PFD粉末（P2116，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）溶解于無(wú)菌水中，配成濃度約5mg/ml（0.5%）的溶液，保存于4℃冰箱內(nèi)，有效時(shí)間為24 h。

1.2 手術(shù)方法和分組

26只新西蘭白兔，體重2.0～2.5 kg，雌雄不限，檢查無(wú)眼部疾患及全身器質(zhì)性疾病。2只作為陰性對(duì)照組。所有實(shí)驗(yàn)操作過程和方法均遵循ARVO委員會(huì)規(guī)定的眼科和視覺科學(xué)相關(guān)的動(dòng)物使用原則，符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)許可。兔子飼養(yǎng)在18～25℃標(biāo)準(zhǔn)的恒溫動(dòng)物箱內(nèi)，12 h光照/黑暗周期，同時(shí)給予標(biāo)準(zhǔn)的食物和水進(jìn)行喂養(yǎng)。24只兔子（24只眼，均為右眼）隨機(jī)分為兩組：所有兔經(jīng)腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉（50mg/kg）和局部用0.5%的鹽酸丙美卡因表面麻醉，0.5%碘伏消毒。鋪巾開瞼，剪去第3眼瞼，置上、下、內(nèi)、外直肌牽引線，固定眼球，在顯微鏡手術(shù)條件下，于右眼上象限鞏膜區(qū)進(jìn)行常規(guī)小梁切除術(shù)。約1/2厚的梯形鞏膜瓣，大小約4mm×3mm×3mm，切除約1.5mm×3.0mm的小梁組織和部分虹膜組織，用10-0尼龍線縫合鞏膜瓣和結(jié)膜瓣，手術(shù)結(jié)束時(shí)結(jié)膜下注射地塞米松1ml。A組給予0.5%（5mg/ml）PFD滴眼液滴眼，B組給予磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）滴眼，連續(xù)使用28 d。所有手術(shù)均在手術(shù)顯微鏡（VISU150，卡爾蔡司，德國(guó)）下進(jìn)行，并由同一熟練操作者完成，術(shù)后涂紅霉素眼藥膏。此外，術(shù)后1周用諾氟沙星滴眼液點(diǎn)手術(shù)眼，3次/d。隨訪至術(shù)后28 d。用0.5%鹽酸丙美卡因麻醉后，用Tonocon眼壓計(jì)記錄兔雙眼眼壓。手術(shù)后1、7、14、21和28 d分別觀察兔眼濾過泡及并發(fā)癥，共聚焦顯微鏡檢查兔眼濾過泡情況，同時(shí)使用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）對(duì)比觀察手術(shù)區(qū)的組織變化。

1.3 共聚焦顯微鏡檢查

采用Confoscan 4裂隙掃描共聚焦顯微鏡（Nidek Co.LTD，日本）檢查。操作步驟[9]：待檢兔眼表面麻醉后，將兔頭部固定顯微鏡前，雙眼固視正前方，檢查者移動(dòng)鏡頭使共焦顯微鏡與結(jié)膜上皮細(xì)胞接觸時(shí)，將鏡頭緩慢向前推進(jìn)，于結(jié)膜濾過泡區(qū)進(jìn)行全層掃描，結(jié)束后選擇有價(jià)值的圖像和錄像存盤，并計(jì)算平均微囊密度及平均微囊面積[10]。

1.4 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

手術(shù)后7、14、21、28和56 d，取濾過泡區(qū)的組織（包括結(jié)膜、筋膜和鞏膜）進(jìn)行CTGF的RT-PCR[3]。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)得到的組織在1m l提取試劑（Trizol試劑，武漢生命技術(shù)有限公司，中國(guó)）中勻漿，用cDNA合成試劑盒（Toyobo，日本）合成cDNA。在實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)（SLAN紅石醫(yī)藥科技有限公司，中國(guó)），使用SYBR預(yù)混的Taq試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR測(cè)定。通過比較閾值循環(huán)方法進(jìn)行結(jié)果分析，并通過管家基因β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graph Pad Prism 4.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，比較兩組眼壓差異、結(jié)膜囊泡密度和面積等用單因素方差分析Studentt檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 濾過泡情況

A組術(shù)后第7天可見有輕微的結(jié)膜充血和良好的濾過泡存在，術(shù)后14 d，結(jié)膜稍充血，濾過泡形成良好，觀察28 d后沒有明顯的炎癥反應(yīng)，濾過泡仍隆起、彌散；B組術(shù)后第7天可見結(jié)膜充血和良好的濾過泡，術(shù)后14 d，結(jié)膜充血減輕，濾過泡平坦，瘢痕形成，觀察28 d后大部分濾過泡瘢痕化。術(shù)后1、7和14 d兩組的濾過泡評(píng)分比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t1d=0.326，t7d=0.652，t14d=0.959，均P>0.05）；術(shù)后21和28 d兩組的濾過泡評(píng)分比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t21d=9.142，t28d=15.741，均P<0.05）（見表1）。觀察兩組無(wú)一例眼內(nèi)炎、前房出血和白內(nèi)障發(fā)生，少數(shù)出現(xiàn)傷口一過性的周圍角膜水腫。

2.2眼壓

手術(shù)前和手術(shù)后1、7、14、21和28 d的早上8～9點(diǎn)測(cè)定眼壓。在術(shù)前每組眼壓與正常對(duì)照組比較，均有明顯降低（tA=6.732，tB=6.837，均P<0.05）。術(shù)后早期眼壓明顯降低，但隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高。術(shù)前及術(shù)后1和7 d，兩組眼壓比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t術(shù)前=0.352，t1d=0.647，t7d=0.753，均P>0.05）；術(shù)后14、21和28 d，兩組眼壓比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t14d=3.463，t21d=4.056，t28d=5.194，均P<0.05）。見表2。

2.3 共聚焦顯微鏡結(jié)果

正常結(jié)膜上皮基底細(xì)胞顯示為光暗的細(xì)胞體，細(xì)胞邊界窄（見圖1A）。經(jīng)過0.5%PFD滴眼液處理28 d的A組在結(jié)膜濾過泡區(qū)上皮及基質(zhì)層出現(xiàn)了許多大小不一的微囊泡，周邊可見部分呈亮光樣炎癥細(xì)胞包繞（見圖1B）；而經(jīng)過PBS處理的B組在結(jié)膜濾過泡區(qū)上皮及基質(zhì)層可見少許的小微囊泡及少量的亮光樣炎癥細(xì)胞（見圖1C）。通過計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過治療28 d后，A組結(jié)膜上皮下平均微囊密度和平均微囊面積分別為（112±22）個(gè)/mm2和（28 589±14 268）μm2，而B組結(jié)膜上皮下平均微囊密度和平均微囊面積分別為（26±19）個(gè)/mm2和（4 989±2 329）μm2，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tmd=16.842，tma=14.894，均P<0.05，見圖1D，1E）。

2.4 mRNA檢測(cè)

A組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)在濾過泡區(qū)CTGFmRNA表達(dá)明顯下調(diào)，而B組CTGF在濾過泡區(qū)CTGF mRNA未見明顯改變，兩組在各時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t7d=2.476，t14d=4.892，t21d=7.638，t28d=9.452，均P<0.05），見圖2。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前和術(shù)后各時(shí)段兔結(jié)膜濾過泡評(píng)分比較 （n=12，±s）

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前和術(shù)后各時(shí)段兔結(jié)膜濾過泡評(píng)分比較 （n=12，±s）

組別 術(shù)前 術(shù)后1 d 術(shù)后7 d 術(shù)后14 d 術(shù)后21 d 術(shù)后28 d A-3.26±0.14 3.72±0.46 3.66±0.65 4.32±0.64 4.17±0.73 3.36±0.25 3.66±0.38 3.23±0.29 3.18±0.43 2.51±0.37 t值 - 0.326 0.652 0.959 9.142 15.741 P值 - 0.973 0.652 0.326 0.048 0.025 B -

表2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前和術(shù)后各時(shí)段眼壓比較 （n=12，mmHg，±s）

表2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前和術(shù)后各時(shí)段眼壓比較 （n=12，mmHg，±s）

組別 術(shù)前 術(shù)后1 d 術(shù)后7 d 術(shù)后14 d 術(shù)后21 d 術(shù)后28 d A 16.24±0.26 12.81±0.38 13.26±0.41 13.45±0.36 13.84±0.43 14.15±0.51 17.46±0.22 12.52±0.42 13.52±0.47 14.57±0.52 16.22±0.58 17.28±0.62 t值 0.352 0.647 0.753 3.463 4.056 5.194 P值 0.982 0.864 0.745 0.044 0.028 0.016 B

圖1 兩組術(shù)后28 d兔結(jié)膜濾過泡的共焦顯微鏡圖像

圖2 兩組兔結(jié)膜手術(shù)區(qū)CTGF mRNA表達(dá)

3 討論

青光眼是導(dǎo)致不可逆性盲的主要原因，是僅次于白內(nèi)障導(dǎo)致失明的第2大常見原因，發(fā)病率約為0.21%～1.64%[11]。目前，濾過性手術(shù)仍是青光眼的主要治療手段，但鞏膜表層、Tenon囊和球結(jié)膜之間成纖維細(xì)胞增生、膠原合成增加等，使濾過道瘢痕化而影響其濾過功能[12]，導(dǎo)致手術(shù)失敗。為了抑制瘢痕形成，防止濾過道瘢痕化，目前術(shù)中常用的抗代謝藥物如5-FU和MMC均可以防止術(shù)后瘢痕形成，但常常會(huì)導(dǎo)致結(jié)膜泡漏、低眼壓、鞏膜溶解、眼內(nèi)炎等并發(fā)癥[13]。此外，研究者發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)類固醇可以減少濾過道纖維細(xì)胞增生。尹寶存[14]采用濾過性手術(shù)聯(lián)合局部點(diǎn)用皮質(zhì)類固醇藥物治療急性閉角型青光眼急性發(fā)作及慢性閉角型青光眼，有效地解決了術(shù)后炎癥和傷口愈合過程中纖維組織增生、濾過道瘢痕化的難題。但其在低濃度時(shí)不僅不能抑制成纖維細(xì)胞增殖，反而能起到促進(jìn)作用，局部低濃度滴藥造成濾過道的纖維化，而結(jié)膜下注射易形成無(wú)功能濾過泡，且長(zhǎng)期應(yīng)用并發(fā)癥多。

術(shù)后濾過道瘢痕化是青光眼濾過手術(shù)后期失敗的主要原因，是眼壓長(zhǎng)期有效控制和視神經(jīng)損害保護(hù)的一個(gè)重大障礙。近年來(lái)，抗濾過道瘢痕化藥物作用被越來(lái)越多的人肯定，手術(shù)聯(lián)合各類抗瘢痕藥物的優(yōu)勢(shì)也逐漸凸顯，在拓寬了手術(shù)適應(yīng)范圍的同時(shí)，也保證了手術(shù)的成功率，增加了青光眼患者復(fù)明的希望。PFD在體外的很多細(xì)胞（例如肝星狀細(xì)胞、腎成纖維細(xì)胞、子宮肌層細(xì)胞及肌瘤細(xì)胞）和許多器官（例如腎、肺和肝臟）有抗炎和抗纖維化的作用。目前，PFD在若干臨床試驗(yàn)中得到了應(yīng)用，包括肥厚性心肌病、肺纖維化、神經(jīng)纖維瘤、子宮平滑肌瘤、特發(fā)性硬皮病、硬化性腹膜炎和輻射誘發(fā)的纖維化等。雖然PFD在眼部的抗纖維化機(jī)制仍不清楚，但有研究表明，PFD能下調(diào)人眼球筋膜成纖維細(xì)胞TGF-β1的mRNA的表達(dá)，對(duì)其增殖、遷移及其在體外的膠原收縮具有明顯的抑制作用。前期已經(jīng)研究了青光眼與全身疾病如阿爾默海茨病[15]、帕金森病[16]等的關(guān)系，以及一部分抗瘢痕的物質(zhì)如紅花保存羊膜[3]、晶狀體前囊膜等[17]在青光眼的應(yīng)用，目前的初步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PFD能調(diào)節(jié)青光眼小梁切除手術(shù)區(qū)的鞏膜瓣和結(jié)膜組織CTGF mRNA的表達(dá)，且濾過泡形成良好，有明顯的抗瘢痕作用。

總之，本文通過實(shí)驗(yàn)對(duì)照，發(fā)現(xiàn)PFD滴眼液在兔小梁切除術(shù)后能減少術(shù)后結(jié)膜鞏膜間的瘢痕愈合。其原因可能是青光眼小梁切除術(shù)后濾過泡容易粘連而產(chǎn)生瘢痕化，而PFD滴眼液能有效抗瘢痕，保持濾過道通暢，所以濾過泡存活得更為持久。隨著細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、組織工程學(xué)的建立及學(xué)科間的交叉發(fā)展，闡明青光眼濾過道愈合的過程，進(jìn)一步研究現(xiàn)有抗纖維化藥物抗瘢痕化的作用機(jī)制，尋找療效好、毒副作用小、來(lái)源豐富的成分，仍是青光眼術(shù)后抗瘢痕化的研究方向。目前，大多數(shù)研究還處于體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，尚有待于進(jìn)一步明確PFD對(duì)青光眼濾過道瘢痕化作用的相關(guān)機(jī)制和細(xì)胞信號(hào)通道，這將為臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的研究奠定可靠的基礎(chǔ)。

[1]KHAW PT,CHANG L,WONG TT,et al.Modulation of wound healing after glaucoma surgery[J].Curr Opin Ophthalmol,2001,12(2):143-148.

[2]ATREIDES SPA,SKUTA GL,REYNOLDS AC.Wound healing modulation in glaucoma filtering surgery[J].Int Ophthalmol Clin,2004,44(2):61-106.

[3]SHAO Y,YU Y,LIU QP,et al.Effects of Honghua preserved amniotic membrane on scar healing in experimental glaucoma surgery[J].Int J Ophthalmol,2014,7(2):226-231.

[4]SARIO AD,BENDIA E,BARONI GS,et al.Effect of pirfenidone on rat hepatic stellate cell proliferation and collagen production[J].J Hepatol,2002,37(5):584-591.

[5]OKU H,NAKAZATO H,HORIKAWA T,et al.Pirfenidone suppresses tumor necrosis factor-alpha,enhances interleukin-10 and protects mice from endotoxic shock[J].Eur J Pharmacol,2002,446(1/2/3):167-176.

[6]GIRI SN,LEONARD S,SHI X,et al.Effects of pirfenidone on the generation of reactive oxygen species in vitro[J].J Environ Pathol Toxicol Oncol,1999,18(3):169-177.

[7]ZHANG S,SHIELS IA,AMBLER JS,et al.Pirfenidone reduces fibronectin synthesis by cultured human retinal pigment epithelial cells[J].Aust N Z J Ophthalmol,1998,26(1):74-76.

[8]KIM H,CHOI YH,PARK SJ,et al.Antifibrotic effect of pirfenidone on orbital fibroblasts of patients with thyroid-associated ophthalmopathy by decreasing TIMP-1 and collagen levels[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2010,51(6):3061-3066.

[9]MASTROPASQUA L,AGNIFILI L,SALVETAT ML,et al.In vivo analysis of conjunctiva in canaloplasty for glaucoma[J].Br J Ophthalmol,2012,96:634-639.

[10]MASTROPASQUA L,AGNIFILI L,CIANCAGLINI M,et al.In vivo analysis of conjunctiva in gold micro shunt implantation for glaucoma[J].Br JOphthalmol,2010,94(12):1592-1596.

[11]QUIGLEY HA,BROMARL AT.The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020[J].Br J Ophthalmol,2006,90(3):262-267.

[12]MAZZA M,CAPUANO A,BRIA P,et al.Ginkgo biloba and donepezil:a comparison in the treatment of Alzheimer's dementia in a randomized placebocontrolled double-blind study[J].Eur J Neurol,2006,13(9):981-985.

[13]HIGGINBOTHAM EJ,STEVENS RK,MUSCH DC,et al.Bleb-related endophthalmitis after trabeculectomy with mitomycin C[J].Ophthalmology,1996,103(4):650-656.

[14]尹寶存.關(guān)于提高濾過性青光眼手術(shù)成功率的討論[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2010,7(10):238.

[15]邵毅,項(xiàng)正兵,余瑤,等.青光眼與阿爾海默病的相關(guān)性研究[J].中國(guó)實(shí)用眼科雜志,2013,31(11):1435-1440.

[16]邵毅,余靜,余瑤,等.青光眼與帕金森病的相關(guān)性[J].中國(guó)老年醫(yī)學(xué)雜志,2014,34(8):2025-2027.

[17]SHAO Y,PEI CG,ZHOU Q,et al.An experiment study on the prevention of scar formation of the filtering bleb by the application of anterior lens capsule in trabeculectomy with cataract surgery in rabbit eyes[J].International Journal of Ophthalmology,2006,6(6):1237-1240.