Nrf2在百草枯中毒致大鼠急性肺損傷中的表達(dá)和意義*

劉振寧，張順，高嵩嵐，郭峰，張紅雷，趙敏

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 急診科，遼寧 沈陽(yáng)110004）

百草枯是一種速效高效觸殺型除草劑，其安全性高而且對(duì)環(huán)境無(wú)害，在全世界范圍內(nèi)得到廣泛使用。我國(guó)作為農(nóng)業(yè)大國(guó)，是目前世界生產(chǎn)和使用百草枯最多的國(guó)家之一。臨床上許多患者自殺性口服或者誤服百草枯成為百草枯中毒就診的主要原因。百草枯的中毒致死劑量較小，而且目前尚無(wú)特效解毒藥物，在臨床上病死率極高[1]。由于肺臟中存在著多胺攝取及其轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[2]，百草枯結(jié)構(gòu)與其相似，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制聚胺類物質(zhì)的攝取及聚集，因此，百草枯中毒主要引起急性肺損傷（acute lung injury，ALI），最終導(dǎo)致呼吸衰竭[3]。

百草枯進(jìn)入機(jī)體被肺泡上皮細(xì)胞攝取后，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，消耗了還原型輔酶Ⅱ（NADPH），并產(chǎn)生大量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)并影響其生物學(xué)功能[4-5]。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化調(diào)節(jié)因子，與炎癥、衰老、腫瘤等很多疾病關(guān)系密切[6]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)Nrf2參與藥物對(duì)ALI的保護(hù)機(jī)制[7-9]，然而Nrf2在百草枯中毒致ALI的過(guò)程中所產(chǎn)生的作用，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)觀察和研究Nrf2在百草枯中毒致ALI中的表達(dá)，探索Nrf2在此過(guò)程中所產(chǎn)生的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百草枯（Sigma，美國(guó)），TNF-α 和IL-1β ELISA試劑盒（R&D，美國(guó)），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物有限公司，中國(guó)），Nrf2抗體（Santa，美國(guó)），TBP抗體（Abcam，美國(guó)），SABC免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色試劑（武漢博士德生物有限公司，中國(guó)），其余均為進(jìn)口或者國(guó)產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

顯微鏡（Olympus，日本），石蠟切片機(jī)和石蠟包埋機(jī)（Leitz，德國(guó)），電泳儀、半干轉(zhuǎn)印儀（BIO-RAD，美國(guó)），高速冷凍離心機(jī)（Sigma，美國(guó)），顯微攝像系統(tǒng)（Q cupture prol Evolution ncp 5.01 BX51，日本）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

48只雄性SpragueDawley大鼠，體重200～250g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)平均分成兩組，百草枯中毒組按照20mg/kg劑量腹腔注射百草枯；對(duì)照組1ml生理鹽水腹腔注射。在相同條件下常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由取食和飲水，房間溫度（25±5）℃、濕度40%～60%，人工照明及黑暗各12h。在腹腔注射百草枯后4、8、24和72 h時(shí)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取出6只大鼠，使用10%水合氯醛300mg/kg腹腔麻醉。麻醉后將大鼠仰臥于鼠臺(tái)上固定，常規(guī)消毒后打開胸腔，使用5m l注射器刺入右心室，緩慢取血，避免溶血。將血放入10ml離心管中，4℃、3 000 r/min，離心10min，取上清分裝至1.5ml EP管中，每管放約0.5ml，置-80℃冰箱保存。心臟采血后，剪掉左心耳，使用生理鹽水沖洗肺組織，待清亮液體流出后，完整取出兩側(cè)肺組織，觀察肺組織顏色、質(zhì)地、有無(wú)出血等病理變化。左肺使用4%多聚甲醛溶液固定，置4℃冰箱中保存；右肺液氮速凍后置于-80℃冰箱保存。

1.4 血清IL-1β、TNF-α、MDA含量和SOD活性測(cè)定

將收集的大鼠血清在4℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清，按照IL-1β、TNF-α、MDA和SOD試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清中IL-1β、TNF-α、MDA含量和SOD活性。

1.5 肺臟濕/干重比值測(cè)定

將右肺中葉用生理鹽水清洗后，濾紙吸干表面水分，稱量肺濕重。然后再把肺葉放入80℃烤箱中48 h后獲得肺組織干重，然后以公式計(jì)算肺濕/干重比值以評(píng)價(jià)肺組織水腫程度。計(jì)算方法：肺臟濕/干重（W/D）=肺濕重（mg）/肺干重（mg）。

1.6 肺組織損傷評(píng)分

取多聚甲醛固定好的大鼠肺組織，切割組織塊，至厚度約0.5 cm左右，常規(guī)組織梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、連續(xù)切片，行HE染色。光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，并按MIKAWA等[10]方法進(jìn)行肺損傷評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：①肺泡充血；②出血；③肺泡腔或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)或聚集；④肺泡壁增厚和/或透明膜形成。分別依據(jù)病變輕重評(píng)0～4分（0：無(wú)病變或非常輕微；1：輕度病變；2：中度病變；3：重度病變；4：極重度病變）。各項(xiàng)評(píng)定分?jǐn)?shù)相加為肺組織損傷總評(píng)分。

1.7 Western blot檢測(cè)肺組織核Nrf2的表達(dá)

按照細(xì)胞核蛋白提取試劑盒說(shuō)明書，提取肺上皮細(xì)胞核蛋白，進(jìn)行蛋白定量后，加樣品緩沖液煮沸5min，各取20μl加樣；使用10%聚丙烯酰胺凝膠在150 V、30 mA條件下電泳1.5 h；50 V條件下PVDF膜轉(zhuǎn)膜2 h；5%脫脂牛奶封閉，滴加Nrf2一抗（1︰50），4℃過(guò)夜；用含0.1% Tween 20的TBS沖洗5min×3次，再加入二抗（1︰500）室溫下孵育2 h，用0.1%TBST沖洗15min×3次，ECL發(fā)光檢測(cè)，X線顯影，掃描圖像，測(cè)得各條帶的灰度值，以TBP為內(nèi)參對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)后，比較其表達(dá)量的變化。

1.8 免疫組織化學(xué)染色

將肺組織切片用0.1mol/L PBS漂洗2次，3%H2O2孵育15min，PBS洗3次，3%Triton X-100孵育15 min。使用0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0）抗原修復(fù)15min，滴加10%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉游離的結(jié)合位點(diǎn)，室溫20min，以減少非特異性染色，傾去切片上血清，滴加1︰500稀釋的兔抗鼠Nrf2抗體，4℃冰箱過(guò)夜。陰性對(duì)照以PBS代替一抗，4℃過(guò)夜。PBS洗3次，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗工作液（1︰200），室溫孵育20min，PBS洗3次，滴加SABC，室溫20min。PBS沖洗5min×4次。DAB顯色劑顯色3min左右，自來(lái)水充分沖洗終止顯色。蘇木素復(fù)染30 s，分色，二甲苯透明，晾干。中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析（one-way，ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清MDA、IL-1β、TNF-α 含量和SOD活性測(cè)定

百草枯中毒組大鼠血清中MDA、IL-1β 和TNFα 含量隨著中毒時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增加，血清中SOD活性則明顯下降，在中毒1 d時(shí)達(dá)到最低值（見(jiàn)圖1）。

2.2 肺濕/干重比值和肺組織損傷評(píng)分

圖1 百草枯中毒大鼠血清MDA、IL-1β、TNF-α 含量和SOD活性

百草枯中毒以后，大鼠肺組織逐漸出現(xiàn)水腫充血，肺濕/干重比值（W/D）隨著中毒時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，在中毒1和3 d時(shí)比較明顯（見(jiàn)圖2A）。顯微鏡下所見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺間質(zhì)水腫，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺損傷評(píng)分明顯增加（見(jiàn)圖2B）。

2.3 核Nrf2蛋白在肺組織中的表達(dá)及蛋白分析

圖2 百草枯中毒大鼠肺濕/干重比值和肺損傷評(píng)分

核Nrf2在正常肺組織上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞少量表達(dá)（見(jiàn)圖3A）。在百草枯中毒4和8 h時(shí)，核Nrf2在肺組織中表達(dá)變化不明顯，在中毒1和3 d時(shí)表達(dá)明顯增強(qiáng)（見(jiàn)圖3B、C）。Western blot結(jié)果表明，核Nrf2在1 d時(shí)達(dá)到高峰，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；3 d時(shí)與對(duì)照組比較，雖然有增加的趨勢(shì)，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見(jiàn)圖3D）。

圖3 核Nrf2蛋白在百草枯中毒大鼠肺組織中的表達(dá)和蛋白分析

3 討論

肺臟作為百草枯作用的主要靶器官，ALI是臨床上急性百草枯中毒的主要并發(fā)癥，臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難和嚴(yán)重低氧血癥。百草枯進(jìn)入機(jī)體被肺泡上皮細(xì)胞攝取后，消耗大量NADPH，干擾正常呼吸鏈電子傳遞，影響生物氧化磷酸化，引起細(xì)胞功能衰竭[4]；此外，還原狀態(tài)的百草枯經(jīng)微粒體NADPH、細(xì)胞色素C還原酶等催化，與分子氧作用形成大量氧自由基包括超氧陰離子O2-、過(guò)氧化氫H2O2、羥自由基OH-等，引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，不飽和脂肪酸變?yōu)轱柡椭舅?，上皮?xì)胞被氧化時(shí)生成MDA，使膜成分交聯(lián)和聚合，破壞膜磷脂結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)的完整性和通透性發(fā)生障礙[5]。ROS的產(chǎn)生還可以激活中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，釋放炎癥細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子（TNF-α 和TNF-β）、白細(xì)胞介素（IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10）等，進(jìn)一步加重肺組織損傷。本研究結(jié)果顯示，在百草枯導(dǎo)致大鼠ALI模型中，肺組織W/D比值升高，肺組織病理顯示肺泡結(jié)構(gòu)破壞、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺間質(zhì)水腫，肺組織損傷評(píng)分明顯增加。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)百草枯中毒后血清中MDA含量增加和抗氧化酶SOD活性降低，說(shuō)明機(jī)體內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是百草枯中毒肺損傷的關(guān)鍵始動(dòng)環(huán)節(jié)，在整個(gè)過(guò)程中起到極其重要的作用。Nrf2是細(xì)胞防御氧化應(yīng)激反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)者[11]，在正常情況下，Nrf2通過(guò)與胞漿蛋白伴侶分子Keap1在胞漿中結(jié)合使其活性處于抑制狀態(tài)，限制Nrf2遷移至細(xì)胞核發(fā)揮功能；在氧化應(yīng)激等條件刺激下，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，Nrf2產(chǎn)生激活并進(jìn)入細(xì)胞核后與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）結(jié)合[12]，即Nrf2/ARE通路，啟動(dòng)下游編碼Ⅱ相解毒酶基因和抗氧化蛋白的轉(zhuǎn)錄[13]，如NAD（P）H醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase，NQO1）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase，GST）[14]、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、SOD[15]、血紅素氧合酶-1（heme oxygen synthase-1，HO-1）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等[16]，有助于維持機(jī)體內(nèi)氧化還原平衡。

研究表明，目前很多呼吸系統(tǒng)疾病包括慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、哮喘、急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）均與Nrf2有關(guān)。將Nrf2基因敲除的小鼠長(zhǎng)期暴露于煙霧中，可以引起更嚴(yán)重的肺氣腫癥狀，體內(nèi)抗氧化酶表達(dá)明顯減少，細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加[17]。高氧狀態(tài)下，與野生型小鼠相比較，Nrf2-/-小鼠肺通透性增加，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞損傷嚴(yán)重，Nrf2下游的多種抗氧化酶（如GST、NQO1和HO-1）的表達(dá)明顯減少[18]。在高潮氣量機(jī)械通氣引起的呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷（ventilator induced lung injury，VILI）小鼠研究中，也有類似發(fā)現(xiàn)，Nrf2-/-小鼠肺泡、血管通透性和炎癥因子水平升高，ARE反應(yīng)性谷胱甘肽合成酶水平減少，氧化還原平衡受到破壞[19]。Nrf2在顱腦損傷所致的ALI中同樣發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，Nrf2-/-小鼠炎癥細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6）表達(dá)增多，抗氧化和解毒酶（NQO1、GST）明顯減少[20]。有學(xué)者研究[21]發(fā)現(xiàn)，多酚表兒茶素酸酯活化Nrf2/ARE通路反應(yīng)可以減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺損傷和纖維化，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧形成氧化性環(huán)境，導(dǎo)致Nrf2激活及其下游基因表達(dá)增加[22]。

本研究結(jié)果顯示，正常大鼠肺組織表達(dá)少量水平的Nrf2蛋白，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示正常大鼠肺組織Nrf2主要位于肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。在百草枯導(dǎo)致肺組織損傷1 d時(shí)，Nrf2蛋白明顯增加，3 d時(shí)有所下降。Nrf2表達(dá)增加可能與百草枯激活體內(nèi)氧化應(yīng)激系統(tǒng)有關(guān)，使得Nrf2與Keap-1解離并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活下游的抗氧化酶，產(chǎn)生保護(hù)作用。有學(xué)者采用重組腺病毒載體Nrf2轉(zhuǎn)染百草枯作用下的A549肺上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激因子以及凋亡相關(guān)因子均有不同程度的降低[23]。這與本研究結(jié)果相似，均提示Nrf2參與了百草枯導(dǎo)致ALI的過(guò)程，產(chǎn)生內(nèi)在的保護(hù)作用。

總之，本研究結(jié)果表明，Nrf2參與了機(jī)體內(nèi)在的保護(hù)作用，Nrf2有望成為治療百草枯中毒新的靶點(diǎn)。如果能使Nrf2表達(dá)增強(qiáng)則可以減輕百草枯的毒性反應(yīng)，從而對(duì)百草枯所引起的ALI產(chǎn)生保護(hù)作用，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

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