過量氟對成骨細(xì)胞非折疊蛋白反應(yīng)的影響*

張亞樓，李甜，王洪波，陳龍，鐘近潔

（新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 組胚教研室，新疆 烏魯木齊830011）

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)是氟骨癥發(fā)生、發(fā)展作用機制之一[1]。鈣連接蛋白（Calnexin，CNX）/鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin,CRT）循環(huán)是真核細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)糖蛋白折疊質(zhì)量的主要監(jiān)控機制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊的蛋白可以通過這兩種分子伴侶CNX/CRT循環(huán)重新折疊，而對于不能正確折疊的蛋白，則由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解蛋白（ER degradation enhancing mannosidase like protein，EDEM）轉(zhuǎn)運至胞漿被蛋白酶體降解。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙時，CNX/CRT循環(huán)發(fā)生異常，錯誤折疊的糖蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙。課題組前期已發(fā)現(xiàn)氟能直接引起成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[2]，而關(guān)于過量氟作用下成骨細(xì)胞內(nèi)這2種重要的分子伴侶表達(dá)的研究尚未見報道。生長停滯與DNA損害可誘導(dǎo)基因34（growth arrest and DNA damage-inducible gene 34，GADD34），在DNA損害、細(xì)胞周期停滯及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙等情況下可表達(dá)上調(diào)[3]。而氟中毒條件下GADD34的表達(dá)情況未見報道。通過了解糖蛋白CNX/CRT及GADD34表達(dá)情況并同時分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子——免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein in pre-B cells，BIP），也稱葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein78，GRP78）的表達(dá)，有助于理解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在成骨細(xì)胞染氟后的意義，對進(jìn)一步設(shè)計/開發(fā)針對氟骨癥診斷和治療的分子靶標(biāo)，有重要的理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，用含10%胎牛血清（LIFE公司）的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，每2～3天根據(jù)細(xì)胞生長的密度和培養(yǎng)液酸堿度的變化更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞染氟模型

Saos-2細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，氟化鈉NaF（分析純，上海生工生物工程技術(shù)有限公司）用培養(yǎng)液配制，濃度分別為5（F-2.26 mg/L）、10（F-4.52 mg/L）、20（F-9.04 mg/L）和40 mg/L（F-18.08mg/L），同時設(shè)立無氟空白對照。染氟時間為24 h。實驗中所用一抗BIP、CNX、CRT、GADD34、β-actin均 購 自Cell Signaling公司，應(yīng)用時1︰1 000稀釋。羊抗兔HRP二抗、羊抗鼠HRP二抗購自武漢博士德。

1.3 成骨細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)檢測

成骨細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)檢測采用免疫印跡技術(shù)，RIPA液提取總蛋白。Bradford法檢測蛋白濃度。取30μg蛋白質(zhì)，與5×上樣緩沖液混合，100℃變性10min。各種一抗以1︰1 000稀釋。12% SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描。通過軟件測定其灰度值，同一樣本檢測蛋白與β-actin灰度比值作為該樣本蛋白的相對量，用于分析。每種蛋白重復(fù)檢測至少2次。

2 結(jié)果

免疫印跡結(jié)果顯示CRT、CNX和BIP蛋白在Saos-2細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，而且3種蛋白表達(dá)各自呈現(xiàn)一定規(guī)律（見圖1A）。氟引起Saos-2細(xì)胞內(nèi)CRT蛋白表達(dá)變化在受試時間點基本一致，僅在NaF 20和40mg/L時表達(dá)輕微上調(diào)，20mg/L時表達(dá)最高，為對照組的1.6倍（P<0.05）（見圖1B）。CNX在NaF 5、10和20mg/L時蛋白表達(dá)水平低于對照組，但有逐漸上升的趨勢。其中5和10mg/L的表達(dá)與對照相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而40mg/L時蛋白表達(dá)水平為染氟細(xì)胞組中最高，但僅比對照組略高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（見圖1C）。隨著染氟劑量的增加，BIP的表達(dá)在5和40mg/L呈現(xiàn)明顯的升高，4個劑量組的表達(dá)水平均高于對照組，尤其是NaF 20和40 mg/L兩組蛋白表達(dá)高于對照組近3倍。BIP的表達(dá)水平和變化趨勢與CNX基本一致（見圖1D）。

圖1 CRT、CNX和BIP蛋白在Saos-2細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)

在各劑量組的Saos-2細(xì)胞內(nèi)GADD34蛋白均未見表達(dá)，而且在宮頸癌Hela細(xì)胞中也未見表達(dá)，而在小鼠腦組織中呈現(xiàn)強陽性表達(dá)。見圖2。

CRT、CNX、BIP和DADD34 4種分子伴侶間的關(guān)系經(jīng)QIAGEN公司在線軟件（http：//gncpro.sabiosciences.com/gncpro/gncpro.php）繪制（見圖3）。BIP可與CNX、CRT共表達(dá)；CNX與CRT之間存在物理相互作用。以上3種分子伴侶可以通過其他的分子伴侶如ATF4、ATF6、XBP1等使GADD34受到影響。

圖2 GADD34在Saos-2細(xì)胞中不表達(dá)

圖3 4種分子伴侶間的相互作用關(guān)系

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum,ER）是蛋白質(zhì)合成與分泌的重要場所。當(dāng)細(xì)胞受到外界的某些刺激時，ER會產(chǎn)生一系列調(diào)節(jié)機制，形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時首先引發(fā)恢復(fù)機制，通過未折疊蛋白反應(yīng)（unfold protein response，UPR）緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；如果長時間不能完全緩解UPR引起的細(xì)胞毒性作用時，可以引起細(xì)胞凋亡[4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)的未折疊蛋白反應(yīng)通過關(guān)閉蛋白翻譯、促進(jìn)分子伴侶表達(dá)、促進(jìn)錯誤折疊蛋白的轉(zhuǎn)運與降解等機制降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在染氟前期的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。

CRT位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，在協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊、調(diào)解鈣離子穩(wěn)態(tài)中起重要作用，表達(dá)缺失時可以損害蛋白和糖蛋白的質(zhì)量控制，該分子適度的表達(dá)上調(diào)可能增強成骨細(xì)胞抗損傷的能力[5]。細(xì)胞內(nèi)鈣超載參與氟骨癥發(fā)病機制并起著重要的作用[6]。在本研究中，除了NaF 20mg/L組（此時F-9.04mg/L）增高外，其余組表達(dá)基本穩(wěn)定，顯示其在減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載反應(yīng)較弱，未能起到保護(hù)作用。

CRT和CNX的底物不同，功能也不相同[7]。本研究結(jié)果顯示CNX蛋白的表達(dá)水平在染氟成骨細(xì)胞中明顯降低，且和染氟劑量相關(guān)。本研究中在5和10mg/L時成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子BIP雖然增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激尚處于可控制階段。此后隨氟劑量的增加，CNX代償性增加，以發(fā)揮其分子伴侶功能及調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)、對抗氧化應(yīng)激的功能。CNX在NaF引起的成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激較強時（NaF 40mg/L），蛋白表達(dá)量上調(diào)，可以增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)承載能力。本研究的結(jié)果表明，CNX參與了過量氟對成骨細(xì)胞前期的病理生理過程，提示CNX/CRT可能是氟中毒發(fā)病的又一重要機制。

BIP的過量表達(dá)能夠減輕成骨細(xì)胞中由氟引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而減緩UPR。同時BIP的高表達(dá)能夠誘導(dǎo)磷酸鈣的形成，促進(jìn)骨細(xì)胞的礦化[8]，這個可能與氟骨癥患者中經(jīng)?？梢砸姷降墓怯不F(xiàn)象有關(guān)。

GADD34在DNA損害、細(xì)胞周期停滯及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙等情況下可表達(dá)上調(diào)[9]。已有報道，氟可以引起成骨細(xì)胞周期停滯，進(jìn)而致細(xì)胞凋亡[10]。對GADD34的研究有助于進(jìn)一步理解氟對成骨細(xì)胞造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，對細(xì)胞周期的影響方式及途徑。本研究中未見此蛋白表達(dá)，今后可以在其他細(xì)胞如原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中進(jìn)行測試分析。

通過本研究發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象，針對分子伴侶CRT和CNX設(shè)計氟中毒疾病的早期預(yù)防與治療方案，可能會為這類疾病的治療，提供一種新的更為有效的手段。

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