多菌種共固定化發(fā)酵制備枸杞紅棗乳酸飲料

徐 敏，田 輝，杜金城，丁秀云，于上富，霍貴成*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

枸杞（Lycium chinense）又名“卻老子”，含有大量VA、VB1、VB2及鐵、鈣等多種礦物質(zhì)元素。紅棗又名大棗，含有豐富的維生素C等，被譽(yù)為“天然維生素丸”[1]。NEDOVIC V A等[2]通過(guò)共固定酵母菌和明串珠菌后，研究其對(duì)蘋(píng)果酒的連續(xù)發(fā)酵的影響，結(jié)果表明，該方法可以較好地改善蘋(píng)果酒的風(fēng)味與質(zhì)量。另外，SCOTT J A等[3]用海綿狀材料將酵母菌與風(fēng)味菌種共固定，然后用于蘋(píng)果酒飲料的生產(chǎn)，結(jié)果表明，應(yīng)用共固定化技術(shù)，酒精發(fā)酵和蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵兩個(gè)過(guò)程，這兩個(gè)發(fā)酵過(guò)程可以在一個(gè)反應(yīng)器中同時(shí)進(jìn)行，大大簡(jiǎn)化了蘋(píng)果酒的生產(chǎn)工藝。在國(guó)內(nèi)對(duì)細(xì)胞共固定化技術(shù)的研究始于陳佩華等[4]采用吸附-包埋的方式，將酵母菌、黑曲霉及其產(chǎn)生的糖化酶共同固定在甘蔗渣上，經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)，直接將淀粉轉(zhuǎn)化為酒精。本研究期望為枸杞紅棗乳酸飲料產(chǎn)業(yè)提供技術(shù)依據(jù)，為提高水果產(chǎn)業(yè)的附加值提供新的動(dòng)力支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞和鮮大棗：市售；保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌粉：乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

蛋白胨、牛肉膏：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨、酵母粉：英國(guó)OXOID公司；葡萄糖、瓊脂、磷酸氫二鉀：天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；硫酸錳、檸檬酸氫二胺、乙酸鈉：天津東麗區(qū)天大化學(xué)儀器廠；Tween-80：天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；以上試劑均為分析純。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1.1 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸氫二氨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水950 mL；固體培養(yǎng)基添加1.6%的瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

豆?jié){機(jī)：九陽(yáng)公司；DU800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)BECKMAN公司；GL-21M離心機(jī)：上海市離心機(jī)械研究所；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；PL2002電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HVE-50全自動(dòng)高壓滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；XK96-A快速混勻器：姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 枸杞紅棗乳酸飲料生產(chǎn)工藝流程

1.3.2 工藝要點(diǎn)

枸杞原汁制備：鮮枸杞清洗后，用豆?jié){機(jī)榨汁后用3層紗布過(guò)濾后5 000 r/min離心10 min，得澄清枸杞原汁，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

棗汁的制備：將新鮮的大棗清洗后人工去核，用豆?jié){機(jī)榨汁后紗布過(guò)濾，以去除大的棗皮，最后5 000 r/min離心20 min，得澄清棗汁，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

菌種活化及菌落觀察：

（1）菌種的活化

將從-20 ℃冰箱取出的乳酸菌在室溫條件下融化，以2%的接種量接種到5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，37 ℃培養(yǎng)14 h后，用混勻器將培養(yǎng)液充分混勻，用接種環(huán)在培養(yǎng)液中輕沾少許液體，在MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行三區(qū)劃線(xiàn)，37 ℃培養(yǎng)。

（2）菌體及菌落形態(tài)的觀察

菌株在MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，選取一個(gè)較大菌落，挑取其中的1/2菌落，進(jìn)行革蘭氏染色和油鏡觀察，并照相。

（3）生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

用接種環(huán)挑取另外的1/2菌落，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)約14 h，以2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)約14 h時(shí)，再以2%接種量分別接種于54個(gè)盛有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，并在54個(gè)試管分別標(biāo)上0、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h、26 h、28 h、30 h（共18個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段3個(gè)平行），37 ℃恒溫培養(yǎng)，從起點(diǎn)開(kāi)始計(jì)時(shí)當(dāng)?shù)竭_(dá)上述時(shí)間時(shí)，將對(duì)應(yīng)的3支試管取出放入4 ℃冰箱中，待18個(gè)時(shí)間段全部取出后一起用紫外分光光度計(jì)測(cè)定pH；采用梯度平板稀釋法測(cè)定0～30 h內(nèi)的活菌數(shù)，重復(fù)3次，作生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

梯度平板稀釋法：無(wú)菌操作，將培養(yǎng)好的菌液搖勻，吸取1 mL加入9 mL無(wú)菌生理鹽水中，制成1∶10的稀釋液，再依次進(jìn)行10倍遞減梯度稀釋?zhuān)吝m當(dāng)稀釋度，吸取1 mL置于滅菌的培養(yǎng)皿中，倒入約15 mL、50 ℃左右的MRS瓊脂培養(yǎng)基，輕輕搖勻。待培養(yǎng)基凝固后，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果以CFU/mL表示。

將混合菌粉接種于MRS液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24 h，傳代2～3次后，取將對(duì)數(shù)期后穩(wěn)定期初的嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌菌液離心（5 000×g，4 ℃，10 min）收集菌體，無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate butter saline，PBS）清洗3次，用無(wú)菌PBS重懸菌體，制備細(xì)胞懸液，并調(diào)整菌濃度為108CFU/mL，于4 ℃儲(chǔ)存，備用。

微生物細(xì)胞固定化方法：將10 mL（菌數(shù)約為108CFU）保加利亞乳桿菌嗜熱鏈球菌細(xì)胞懸液，加入一定含量的海藻酸鈉溶液（固定化載體溶液），用渦旋振蕩器混勻5 min，用一次性注射器取20 mL左右的海藻酸鈉溶液，滴進(jìn)氯化鈣溶液（固定化顆粒），進(jìn)行造粒，4 ℃條件，固定化20 h左右備用。

發(fā)酵原液的調(diào)配：取適量的枸杞汁，然后用飽和碳酸鈉溶液調(diào)pH，當(dāng)pH值約為7.0時(shí)，對(duì)發(fā)酵原液進(jìn)行巴氏消毒，然后室溫條件下冷卻20 min，再按一定的比例加入大棗汁，以此，制備發(fā)酵原液[5-7]。

1.3.3 測(cè)定方法

固定化載體機(jī)械強(qiáng)度的測(cè)定方法：在固定化載體的正面，用50 g砝碼按壓，以其能承受的最大壓力來(lái)表示固定化載體的機(jī)械強(qiáng)度；固定化載體的機(jī)械強(qiáng)度計(jì)算公式[8]：

式中：d為施壓前后固定化載體的直徑差，mm；50為砝碼質(zhì)量，g；R為施壓前固定化載體的半徑，mm；r1、r2、r3為施壓后固定化載體的半高度，mm；π為圓周率3.14；Pi為固定化載體的機(jī)械強(qiáng)度，g/mm2；P為平均固定化載體的機(jī)械強(qiáng)度，g/mm2。

還原糖及乳酸測(cè)定方法：還原糖的含量測(cè)定采用DNS法；乳酸的含量測(cè)定采用酸堿滴定法[9]。

感官評(píng)價(jià)指標(biāo)：隨機(jī)選取50名性別不同、年齡各異、語(yǔ)言表達(dá)能力強(qiáng)的人員進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，每組20人均進(jìn)行評(píng)分，排除偏差，試驗(yàn)結(jié)果取平均值，然后進(jìn)行分析，枸杞紅棗乳酸飲料的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1（滿(mǎn)分100分）。

表1 枸杞紅棗乳酸飲料的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of Lycium chinense and date yoghourt drink

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞汁、大棗汁比例對(duì)發(fā)酵的影響

枸杞汁、大棗汁的比例一定程度上影響著乳酸菌的發(fā)酵效果，以枸杞汁與大棗汁體積比1∶6、1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、6∶1的比例[10-12]，接種量為10%的混合菌株，37 ℃發(fā)酵26 h進(jìn)行試驗(yàn)，以感官評(píng)價(jià)為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出兩種果汁最佳配比，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 發(fā)酵原液配比對(duì)發(fā)酵的影響Table 2 Effect of fermentation broth ratio on fermentation

由表2可知，隨著枸杞汁所占比例的增大，組織狀態(tài)逐漸變差、酸味逐漸變?nèi)酰昏坭街c大棗汁的體積比為1∶2時(shí)能達(dá)到較好的產(chǎn)酸效果又不會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重分層現(xiàn)象；所以選擇枸杞汁和大棗汁的比例為1∶2進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 海藻酸鈉和氯化鈣對(duì)固定化顆粒特性的影響

氯化鈣和海藻酸鈉是影響固定化載體特性的主要因素；故選取氯化鈣濃度和海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不同比例，以機(jī)械強(qiáng)度為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)，從而選出適宜的兩者比例用于制備紅棗枸杞乳酸飲料。參考相關(guān)文獻(xiàn)[13]，本試驗(yàn)設(shè)置了4個(gè)氯化鈣濃度：0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.15 mol/L、0.20 mol/L和4個(gè)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)：4%、5%、6%、7%；試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 海藻酸鈉含量和氯化鈣濃度對(duì)固定化顆粒特性的影響Table 3 Effect of calcium chloride and sodium alginate concentration on immobilized yeast characteristics

由表3可知，隨著氯化鈣含量的減小，固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)；而同時(shí)，隨著海藻酸鈉含量的減小，整體上，固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度的趨勢(shì)為減小趨勢(shì)；氯化鈣濃度與機(jī)械強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)，而海藻酸鈉含量與機(jī)械強(qiáng)度之間呈正相關(guān)。當(dāng)氯化鈣濃度為0.05 mol/L，海藻酸鈉含量為7%時(shí)，固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度可達(dá)23.11 g/mm2；因此13號(hào)處理為最優(yōu)組合，即氯化鈣濃度為0.05 mol/L，海藻酸鈉含量為7%，選擇此組合進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 接種量對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響

在上述最優(yōu)條件獲得的基礎(chǔ)上，參考相關(guān)文獻(xiàn)[14-15]，關(guān)于乳酸菌的接種量，分別選取2%、6%、10%、14%、18%五個(gè)梯度，37 ℃發(fā)酵26 h；以乳酸飲料組織狀態(tài)、口感為指標(biāo)，篩選出混合菌株最佳接種量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 混合菌株接種量對(duì)產(chǎn)品組織狀態(tài)的影響Table 4 Effect of mixed strains inoculum on organization status of product

由表4可知，隨著接種量的增加，組織狀態(tài)越差，容易分層，而酸味隨著接種量的增加而增加；綜合考慮，選取混合菌株的接種量為10%。

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響

在上述最優(yōu)條件的基礎(chǔ)上，參考相關(guān)文獻(xiàn)[16]，在接種量為10%，37 ℃條件下分別發(fā)酵15 h、25 h、35 h、45 h，以乳酸飲料色澤、口感為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出混合菌株最佳發(fā)酵時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響Table5 Effect of fermentation time on product quality

從表5可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸飲料的顏色越深；然而，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸飲料的酸味越重；當(dāng)浸提時(shí)間為35 h時(shí)，飲料的色澤和口感較佳，故選擇的發(fā)酵時(shí)間為35 h。

2.5 蔗糖添加量的確定

參考本研究預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果及相關(guān)參考文獻(xiàn)，選取蔗糖添加量4%、6%、8%、10%4個(gè)添加梯度[17]，按照工藝流程圖與枸杞紅棗果汁混合物混合，斡旋振蕩器振蕩10 min，然后加入嗜熱鏈球菌保加利亞乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，以感官評(píng)價(jià)得分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定制備枸杞紅棗乳酸飲料蔗糖的最佳添加量。

表6 蔗糖添加量對(duì)乳酸飲料品質(zhì)的影響Table 6 Effect of sucrose addition on product quality

由表6看出，隨著蔗糖添加量的變大，組織狀態(tài)越來(lái)越有厚重感，而味道越來(lái)越甜；當(dāng)添加量為8%時(shí)，產(chǎn)品的組織狀態(tài)與風(fēng)味均達(dá)到了較好的狀態(tài)，綜合各方面的因素考慮，初定確定蔗糖添加量為8%。

2.6 正交試驗(yàn)

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，本研究初步認(rèn)為影響枸杞紅棗乳酸飲料品質(zhì)的主要因素為保加利亞乳桿菌嗜熱鏈球菌混合菌接種量、蔗糖添加量和發(fā)酵時(shí)間，所以以接種量、蔗糖添加量和發(fā)酵時(shí)間為3個(gè)試驗(yàn)因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，其因素與水平見(jiàn)表7。

表7 枸杞紅棗乳酸飲料發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 7 Factors and levels of orthogonal experiment for Lycium chinense and date drink fermentation conditions optimization

表8 枸杞紅棗乳酸飲料發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 8 Results and analysis of orthogonal experiment for Lycium chinense and date drink fermentation conditions optimization

由表8可知，影響品質(zhì)的重要因素為接種量，其次為蔗糖添加量；從9個(gè)處理可以直觀的看出，最好的組合是A2B2C3，即接種量為10%，發(fā)酵時(shí)間為35 h，蔗糖添加量為9%。在此最佳條件下，感官評(píng)分為92分。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，當(dāng)枸杞汁、紅棗汁的體積比為1∶2，氯化鈣物質(zhì)的量濃度為0.05 mol/L，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%，接種量為10%，發(fā)酵時(shí)間為35 h，蔗糖添加量為9%，添加適量甜味劑、乳酸鈣等輔料時(shí)，枸杞紅棗乳酸飲料產(chǎn)品品質(zhì)良好，發(fā)酵速度適宜。

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