超聲波輔助萃取-氣相色譜法測定青椒中有機磷農(nóng)藥殘留的研究

顏 琪

（甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730030）

青椒營養(yǎng)價值高，富含VB、VC、胡蘿卜素等，尤其是VC的含量是番茄的7～15倍，具有促進消化、預防癌癥等功效[1]。有機磷農(nóng)藥是繼有機氯農(nóng)藥以后被廣泛使用的一類高效、廣譜的化學殺蟲劑，因其易降解、價格低廉等特點[2]在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛的應用。目前生產(chǎn)使用的多為高效低毒低殘留的品種（如敵敵畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷等[3]）。

雖然農(nóng)藥的施用可以有效提高蔬菜制品的質量品質，但是蔬菜中農(nóng)藥殘留超標會對人體造成急、慢性中毒，引起神經(jīng)紊亂、精神失常等病癥，導致癌癥、畸形、突變等危害[4]。蔬菜的安全問題尤其是農(nóng)藥殘留問題已經(jīng)引起了各國政府的高度重視和社會公眾的廣泛重視。旨在保障公眾身體健康和生命安全的《中華人民共和國食品安全法》中，農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留檢測項目日益增多、限量要求日益嚴格[5-6]。因此，對蔬菜中農(nóng)藥殘留進行檢測，是食品衛(wèi)生與安全監(jiān)督的重要環(huán)節(jié)，也是高效、合理使用農(nóng)藥的技術保障，對降低蔬菜中農(nóng)藥殘留、中毒事件的發(fā)生，保障人民身體健康具有重要意義。

目前，有機磷類農(nóng)藥檢測方法有光譜法、試紙法技術、色譜法、免疫學方法、生物傳感器與生物芯片技術[7-9]。由于有機磷農(nóng)藥大部分具有較好的揮發(fā)性，且氣相色譜法的檢測器靈敏度高，是對有機磷類農(nóng)藥最有效的分離手段[10]。本研究采用超聲波輔助萃取-氣相色譜法，旨在建立安全有效萃取青椒中5種有機磷農(nóng)藥的技術方法，通過響應面試驗優(yōu)化有機磷農(nóng)藥溶劑萃取條件，得到最優(yōu)的技術參數(shù)，達到有效提高農(nóng)藥提取率的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機抽取市售青椒50份。

農(nóng)藥標準品：（1）標準溶液儲備液：敵敵畏（dichlorvos）、甲胺磷（methamidophos）、乙酰甲胺磷（acephate）、氧樂果（omethoate）、倍硫磷（fenthion），質量濃度為100 μg/mL；（2）混合標準溶液：分別取有機磷類農(nóng)藥標準溶液儲備液，以丙酮定容，配制成質量濃度為5.00 mg/kg的混合標準溶液，再逐漸稀釋成0.50 mg/kg、0.05 mg/kg。

丙酮（色譜純，經(jīng)重蒸）、乙腈（色譜純）、氯化鈉（分析純，140 ℃烘烤4 h）：天津市光復科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 6890氣相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；XH-B漩渦混合器：姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司；N-EVAP氮吹儀：美國Organomation公司；H09-T25勻漿機：德國IKA集團；ME梅特勒分析天平：武漢宏錦科技有限公司；0.2 μm微孔濾膜：天津富集科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備

將抽取的青椒樣品取可食部分，切碎，充分混勻，以四分法取樣，放入5.00 mg/kg有機磷混合標準農(nóng)藥中浸泡15 min，陰暗處放置24 h備用。

1.3.2 有機磷農(nóng)藥檢測方法

（1）有機磷農(nóng)藥的測定方法

參考NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》[11]的方法并予以改進：準確稱取25.0 g青椒試樣，加入一定體積的乙腈，在勻漿機中高速勻漿2 min后，超聲提取一定時間，通過濾紙過濾至裝有5～7 g氯化鈉[12]的100 mL具塞量筒中，渦旋振蕩1 min，室溫條件下靜置30 min使其分層。從具塞量筒中吸取10.00 mL乙腈，一定水浴溫度條件下氮吹蒸發(fā)至近干，最后用丙酮定容至2.0 mL，0.2 μm濾膜過濾。以保留時間定性，峰面積外標法定量，在相同色譜條件下，分別將標準溶液及樣品溶液經(jīng)氣相色譜分析。

（2）氣相色譜測定條件

色譜柱：聚苯基甲基硅氧烷（DB-17）色譜柱（30 m×0.53 mm×1.0 μm）；進樣口溫度：220 ℃；進樣方式：不分流進樣；檢測器：火焰光度檢測器（溫度為250 ℃）；柱溫：150 ℃保持2 min，以8 ℃/min的速度升至250 ℃保持12 min；載氣：氮氣流速為10 mL/min；進樣量1.0 μL。

（3）回收率的計算

式中：X為試樣中實測有機磷農(nóng)藥的含量，mg/kg；A為試樣所含有機磷農(nóng)藥的含量，mg/kg；B為加入標品量，mg/kg。

1.3.3 有機磷農(nóng)藥溶劑萃取條件的優(yōu)化

表1 萃取條件優(yōu)化響應面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment for extraction condition optimization

在單因素試驗基礎上，選定超聲時間、料液比和水浴溫度對有機磷農(nóng)藥萃取效果影響顯著的3個因素進行優(yōu)化，根據(jù)中心旋轉組合設計和數(shù)據(jù)處理，確定最佳萃取條件。選取超聲時間（A）、料液比（B）、水浴溫度（C）為試驗因子，以有機磷農(nóng)藥的回收率Y為響應值，試驗因素與編碼水平設計見表1。

2 結果與分析

2.1 樣品的預處理

樣品預處理過程中采用勻漿、過濾和振蕩的方法，通過這些方法可以增加農(nóng)藥殘留量的提取率。有機磷類農(nóng)藥的測定中，用乙腈與丙酮作為農(nóng)藥提取劑及分配凈化劑[13]。李四生等[14]認為提取中采用鹽析作用有利于兩相分層，提高有機磷農(nóng)藥在有機相中的分配系數(shù)，從而提高萃取率。故本試驗采用加入過量的氯化鈉，更加有利于乙腈從水相中分離出來，從而提高有機磷農(nóng)藥在乙腈中的濃度。用氮吹儀代替旋轉蒸發(fā)儀進行濃縮，濃縮效率高，農(nóng)藥損失率低，溶劑處理量小[15]。

2.2 色譜條件

色譜柱類型、柱溫度、載氣流速是影響氣相色譜分離效果、分析時間長短和方法靈敏度的主要因素[16]。本試驗農(nóng)藥殘留的檢測中，如果選用恒溫，則農(nóng)藥出峰時間長，峰形差，不能得到有效分離。因此采取程序升溫，能兼顧高、低沸點組分的分離效果和分析時間，使不同沸點的組分基本上都能在其較合適的柱溫條件下進行分離。色譜柱選擇聚硅氧烷類，其極性范圍廣（從弱極性到強極性），選擇性強，能滿足多種有機磷農(nóng)藥殘留的分析測定[17-18]。

2.3 檢測方法可靠性分析

2.3.1 有機磷農(nóng)藥檢測方法

圖1 5種有機磷農(nóng)藥標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard solutions of five organophosphorous pesticides

按上述氣相色譜條件分析測定，5種有機磷農(nóng)藥混合標準樣品色譜圖見圖1，可以看出，敵敵畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化樂果、倍硫磷在其保留時間（分別為2.249 min、2.784 min、4.533 min、5.310 min、5.717 min）處都具有明顯而尖銳的峰，峰形對稱，基線平穩(wěn)，5種農(nóng)藥在6 min內(nèi)可獲得良好分離。其中的雜峰基本上對標樣的組分沒干擾，分離效果好。說明采用的檢測條件合適，方法可行。

2.3.2 方法的精密度、準確度及靈敏度

測定方法的準確度、精密度和靈敏度分別以全過程的加標回收率、相對標準偏差（relative standard deriation，RSD）及檢出限衡量。按1.3.2檢測方法，在25.0 g青椒試樣中分別添加質量濃度為0.05 mg/kg、0.50 mg/kg、5.00 mg/kg的5種有機磷農(nóng)藥混合標準溶液1 mL進行加標回收率試驗，測出回收率并計算相對標準偏差。加標回收率、相對標準偏差及檢出限結果見表2。

表2 5種有機磷農(nóng)藥的檢出限、加標回收率與相對標準偏差Table 2 Limit of detection,recovery rates and RSD of five organophosphorous pesticides

由表2可以看出，5種有機磷農(nóng)藥的平均回收率為78.6%～93.6%，RSD≤5.2%，檢出限范圍為0.008～0.015 mg/kg，方法的回收率較高，相對標準偏差較低，檢出限符合對農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測的要求[19]。說明該方法具有良好的準確度、精密度和靈敏度。采用本試驗的檢測方法檢測這5種農(nóng)藥在青椒中的殘留量是可行的，均可達到定量分析的要求，方法準確可靠。

2.4 響應面法優(yōu)化有機磷農(nóng)藥的溶劑萃取條件

2.4.1 回歸方程及方差分析

以有機磷農(nóng)藥的回收率作為響應值，對超聲時間（A）、料液比（B）、水浴溫度（C）進行3因素3水平響應面中心組合試驗設計，結果見表3，方差分析見表4，模型可信度分析見表5。

由表3、表4所得的多項式回歸模型為：Y=-241.74+10.31A-21.64B+7.46C-0.11AB-0.087AC+0.45BC-0.13A2-3.78B2-0.045C2。該模型在α=0.01的水平上高度顯著，失擬項不顯著（P＞0.05）。根據(jù)回歸方程各個系數(shù)絕對值的大小可判斷3個因素對有機磷農(nóng)藥的回收率的影響順序為料液比＞超聲時間＞水浴溫度。

表3 萃取條件優(yōu)化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiment for extraction condition optimization

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

表5 模型可信度分析Table 5 Reliability analysis for model

由表5可知，復相關系數(shù)R2=0.910 3，表明有機磷農(nóng)藥回收率響應值的0.910 3是由所選變量超聲時間、料液比、水浴溫度引起，回收率的實際值與理論預測值之間具有較好的擬合相關性。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）越低，試驗的可信度和精確度越高，CV值等于3.72%，表示該試驗的可信度和精確度較高。綜上所述，所得回歸方程為有機磷農(nóng)藥溶劑萃取條件的優(yōu)化提供了合適的模型，可代替真實試驗點對農(nóng)藥回收率進行預測。

2.4.2 響應面分析及最優(yōu)萃取條件的確定

對超聲時間、料液比及水浴溫度3個因素，進行兩兩交互作用分析，得到響應面圖（反映各個試驗因素對響應值的影響程度）和等高線圖（反映最佳條件下各個試驗因素的值）。從圖2可以看出，超聲時間和水浴溫度、料液比和水浴溫度的交互作用顯著，超聲時間和料液比交互作用不顯著。

圖2 超聲時間、料液比與水浴溫度交互作用對回收率影響的響應面及等高線圖Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between ultrasonic time,solid-liquid ratio and water bath temperature on recovery rate

對所得的回歸模型進行數(shù)學分析，得出有機磷農(nóng)藥的最佳萃取條件為超聲時間13.4 min、料液比1∶1.5（g∶mL）、水浴溫度76.7 ℃。在此最優(yōu)萃取條件下，有機磷農(nóng)藥的回收率理論值為97.05%。

2.4.3 驗證試驗

為了進一步驗證響應面分析法的可靠性，采用上述最優(yōu)條件萃取有機磷農(nóng)藥，實際測得到的回收率為96.82%，與理論值相比，誤差為0.23個百分點。因此，該模型合理有效，采用響應面分析優(yōu)化得到的最優(yōu)萃取條件參數(shù)真實可靠，可用于實際操作。

3 結論

本研究采用超聲波輔助萃取-氣相色譜法，旨在建立安全有效地萃取青椒中5種有機磷農(nóng)藥的技術方法，通過響應面試驗優(yōu)化有機磷農(nóng)藥溶劑萃取條件，得到最優(yōu)的技術參數(shù)，各因素對回收率的影響次序是：料液比＞超聲時間＞水浴溫度；通過中心組合設計及響應面分析獲得的最佳工藝參數(shù)為超聲時間13.4 min、料液比1∶1.5（g∶mL）、水浴溫度76.7 ℃，理論回收率為97.05%，實測值為96.82%。該方法相對標準偏差是2.1%～5.2%，檢出限的范圍是0.008～0.015 mg/kg。所得的優(yōu)選方法為有機磷農(nóng)藥溶劑萃取條件提供了擬合度很高的模型，更準確地代替真實試驗點對回收率進行預測，具有一定的實際應用性。與傳統(tǒng)方法相比，該法操作簡便，提高了分析效率及檢測靈敏度，適用于大批量檢驗工作，進一步為有機磷農(nóng)藥的檢測研究提供一定基礎，對確保公眾食用安全放心的青椒具有重要的現(xiàn)實意義。建立的5種有機磷農(nóng)藥殘留的檢測方法可行，適于推廣。

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