復(fù)合酶輔助熱水浸提法提取榆樹(shù)皮多糖工藝研究

魏 征，馬韻升，劉圣鵬，虞鳳慧，王杉杉

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500；2.山東京博控股股份有限公司，山東 濱州 256500）

榆樹(shù)（Ulmus pumilaL.）在我國(guó)自然分布較廣，且耐寒、耐旱、耐貧瘠。榆樹(shù)根系發(fā)達(dá)，抗風(fēng)保土能力極強(qiáng)，可以在較為干旱的貧瘠荒丘上生長(zhǎng)，資源豐富。榆樹(shù)皮又稱榆白皮，主要有利水、通淋、消腫等功能[1]。其皮中富含各種有機(jī)物質(zhì)，如多糖類、膠質(zhì)、木質(zhì)素等[2]。現(xiàn)確定植物多糖的主要功能有調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤、延緩衰老、降血糖等作用[3]。榆樹(shù)皮多糖具有很強(qiáng)的還原能力，對(duì)羥自由基和超氧自由基在一定程度上有抑制和清除作用[4]，可以作為天然抗氧化劑。

隨著人們對(duì)多糖食用、藥用價(jià)值重視程度的提高，目前多糖的實(shí)驗(yàn)室提取方法已經(jīng)比較成熟，主要有水提法、堿液提取法、溶劑提取法、超聲波萃取法、微波法、酶法等[5]。近年來(lái)，超濾膜技術(shù)和超臨界萃取技術(shù)也逐漸應(yīng)用于多糖提取領(lǐng)域[6]。傳統(tǒng)方法中多糖的提取采用回流法[7-8]，該方法提取率低，極易導(dǎo)致多糖的降解，影響其活性。酶技術(shù)的提取條件溫和，破壞細(xì)胞壁能力強(qiáng)，可以水解植物中的膠質(zhì)，能充分釋放細(xì)胞里的活性成分，已被廣泛應(yīng)用于植物中有效成分的提取[9-13]。本試驗(yàn)采用復(fù)合酶輔助熱水浸提法對(duì)榆樹(shù)皮多糖提取工藝進(jìn)行研究，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)對(duì)榆樹(shù)皮多糖的提取時(shí)間、提取溫度、料液比進(jìn)行優(yōu)化，旨在獲得一種得率高、品質(zhì)好的榆樹(shù)皮多糖提取條件，從而為榆樹(shù)皮多糖的工業(yè)生產(chǎn)、開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榆樹(shù)皮：山東博華農(nóng)業(yè)有限公司；纖維素酶（20000U/g）：實(shí)驗(yàn)室自制；果膠酶（200 000 U/g）：蘇柯漢濰坊生物工程有限公司；葡萄糖（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）、苯酚（分析純）、硫酸（分析純）：萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

FA-2004型分析天平：上海上平儀器有限公司；HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市融化儀器制造有限公司；JJ-1型精密增力電動(dòng)攪拌器：上海浦東物理光學(xué)儀器銷售部；DL-6M大型低速離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)科技有限公司；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；752N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康有限公司。

1.3 方法

1.3.1 榆樹(shù)皮多糖提取工藝流程

榆樹(shù)皮粉末→乙醇脫脂→復(fù)合酶浸提→熱水浸提→離心→Sevage法除蛋白→濃縮→冷凍干燥→榆樹(shù)皮多糖粗品

1.3.2 榆樹(shù)皮多糖提取操作要點(diǎn)

緩沖溶液的配制：分別配制0.1 mol/L的檸檬酸及檸檬酸鈉溶液，并按比例配成pH 4.6的緩沖溶液。

復(fù)合酶液配制：稱取等質(zhì)量的纖維素酶和果膠酶，加入10倍體積的緩沖溶液，40 ℃水浴活化20 min。

精確稱取粉碎的榆樹(shù)皮粉末10 g，加入15倍體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇，于80 ℃水浴脫脂1 h，冷卻、離心、收集濾餅備用。將濾餅按料液比1∶10（g∶mL）加入蒸餾水，向榆樹(shù)皮水溶液中加入0.2%的復(fù)合酶（纖維素酶/果膠酶為1∶1），在45 ℃條件下浸提1 h，100 ℃滅酶10 min，冷卻，在4 000 r/min條件下離心，收集濾餅，加入蒸餾水，在水浴鍋中浸提一定時(shí)間后，離心，合并2次上清液，Sevage法除蛋白，減壓濃縮至原體積的1/5，冷凍干燥得到榆樹(shù)皮多糖粗品。

1.3.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[14-17]

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取在105 ℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g，置于50 mL燒杯中加蒸餾水溶解，并全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，另取10 mL該溶液于100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密吸取0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL（相當(dāng)于葡萄糖含量0、0.02 mg、0.04 mg、0.06 mg、0.08 mg、0.10 mg、0.12 mg），分別置于25 mL比色管中，準(zhǔn)確補(bǔ)充蒸餾水至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，小心加入濃硫酸5.0 mL，在旋轉(zhuǎn)均勻器上小心混勻，冷卻后，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)其吸光度值，以試劑空白溶液為參比，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 樣品中多糖含量測(cè)定

取干燥榆樹(shù)皮粗多糖供試品，將其稀釋至合適倍數(shù)，精確吸取待測(cè)液2 mL置于25 mL比色管，按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定其吸光度值。從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算葡萄糖的質(zhì)量，計(jì)算樣品中多糖含量。多糖含量的計(jì)算公式如下：

式中：C為供試液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，μg/mL；D為樣品液的稀釋因素；F為換算因子；m為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.5 多糖得率的計(jì)算

榆樹(shù)皮多糖的得率計(jì)算公式如下：

式中：Y為榆樹(shù)皮多糖得率，%；m1為榆樹(shù)皮粗多糖質(zhì)量，g；m0為榆樹(shù)皮樣品質(zhì)量，g。

1.3.6 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

固定工藝中酶解條件（濾餅按料液比1∶10（g∶mL）加入蒸餾水，向榆樹(shù)皮水溶液中加入0.2%的復(fù)合酶（纖維素酶/果膠酶為1∶1），在45 ℃，pH 4.6條件下浸提1 h，100 ℃滅酶10 min），分別設(shè)定提取溫度為55℃、65℃、75 ℃、85 ℃、95 ℃，在料液比1∶20、1∶30、1∶50、1∶70、1∶90（g∶mL）條件下分別提取1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，100 ℃滅酶10 min，冷卻，過(guò)濾，Sevage法除蛋白后，濃縮至原體積的1/5，冷凍干燥，制得粗多糖。計(jì)算榆樹(shù)皮多糖得率，分別考察提取溫度、時(shí)間、料液比對(duì)榆樹(shù)皮多糖得率的影響。

1.3.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）為3個(gè)對(duì)榆樹(shù)皮多糖得率有影響的因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，以榆樹(shù)皮多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，最終確定榆樹(shù)皮多糖提取的最優(yōu)工藝條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 榆樹(shù)皮多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for elm bark polysaccharide extraction conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用硫酸-苯酚法測(cè)定不同質(zhì)量的葡萄糖在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度值，以葡萄糖含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，在葡萄糖含量0～0.12 mg范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=8.002 1x-0.015 5，擬合系數(shù)R2=0.998 1，表明葡萄糖含量與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2 各單因素對(duì)榆樹(shù)皮多糖提取效果的影響

2.2.1 提取溫度對(duì)榆樹(shù)皮多糖提取效果的影響

不同提取溫度條件下的榆樹(shù)皮多糖得率如圖2所示。

圖2 溫度對(duì)榆樹(shù)皮多糖得率的影響Fig.2 Effect of temperature on elm bark polysaccharide yield

由圖1可知，不同的提取溫度對(duì)多糖得率有明顯的影響。結(jié)果表明，浸提溫度在55～75 ℃的范圍內(nèi)，多糖得率隨著提取溫度的升高而增加；提取溫度＞75 ℃，繼續(xù)提高提取溫度，得率反而降低，可能是隨著提取溫度的升高，糖苷鍵容易斷裂，多糖分解，從而影響多糖得率。因此，選擇提取溫度為75 ℃最佳。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)榆樹(shù)皮多糖提取效果的影響

不同提取時(shí)間條件下的榆樹(shù)皮多糖得率如圖3所示。

圖3 提取時(shí)間對(duì)榆樹(shù)皮多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on elm bark polysaccharide yield

由圖3可知，多糖得率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，原因是時(shí)間的延長(zhǎng)有利于多糖的溶出，增加了多糖在溶劑中的溶解度。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到2.5 h時(shí)，多糖得率達(dá)到12.6%，此后繼續(xù)增加提取時(shí)間，多糖得率得變化趨勢(shì)較平緩，表明多糖浸出已基本完成。因此，選擇2.5 h作為提取時(shí)間較適宜。

2.2.3 料液比對(duì)榆樹(shù)皮多糖提取效果的影響

不同料液比條件下的榆樹(shù)皮多糖得率如圖4所示。

由圖4可知，料液比在1∶20～1∶70（g∶mL）的范圍內(nèi)，多糖得率隨著料液比的增加而增加；料液比＞1∶70（g∶mL）后，繼續(xù)增大料液比多糖得率反而降低，可能是因?yàn)榱弦罕鹊脑黾佑欣陔s質(zhì)等非糖成分的溶出，考慮到料液比過(guò)大也會(huì)增加后期濃縮分離的能源消耗，因此選擇料液比1∶70（g∶mL）最佳。

圖4 料液比對(duì)榆樹(shù)皮多糖得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on elm bark polysaccharide yield

2.3 提取榆樹(shù)皮多糖的工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)提取時(shí)間、提取溫度、料液比進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 榆樹(shù)皮多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for elm bark polysaccharide extraction conditions optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，根據(jù)極差R的大小，可以判斷各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響主次。可見(jiàn)影響榆樹(shù)皮多糖得率的因素主次順序?yàn)锽＞A＞C，即提取時(shí)間＞提取溫度＞料液比。榆樹(shù)皮多糖提取的最優(yōu)方案為A1B3C2，即提取溫度70 ℃，提取時(shí)間3.0 h，料液比1∶70（g∶mL）。在此最優(yōu)提取條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，榆樹(shù)皮多糖得率達(dá)到13.143%，高于正交試驗(yàn)表中最大得率12.869%，故可以認(rèn)為該組合為復(fù)合酶輔助熱水浸提法提取榆樹(shù)皮多糖的最佳提取工藝。

由表3方差分析可知，提取時(shí)間、提取溫度、料液比對(duì)榆樹(shù)皮多糖的得率均無(wú)顯著影響。

2.4 對(duì)比試驗(yàn)

為了考察復(fù)合酶輔助熱水浸提法提取榆樹(shù)皮多糖的得率，在提取時(shí)間、提取溫度、料液比相同的條件下，與傳統(tǒng)的熱水浸提法進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。

表4 兩種榆樹(shù)皮多糖提取方法的比較Table 4 Comparison of two extraction methods of elm bark polysaccharide

由表4可知，與傳統(tǒng)熱水浸提法相比，復(fù)合酶輔助熱水浸提法提取榆樹(shù)皮多糖得率提高超過(guò)3個(gè)百分點(diǎn)，說(shuō)明復(fù)合酶輔助熱水浸提法能有效促進(jìn)榆樹(shù)皮多糖的提取。

3 結(jié)論

本研究采用復(fù)合酶輔助熱水浸提法提取榆樹(shù)皮多糖。通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)，以榆樹(shù)皮多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)提取條件為提取溫度70 ℃，提取時(shí)間3.0 h，料液比1∶70（g∶mL），復(fù)合酶添加量0.2%。并在此最優(yōu)提取條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，榆樹(shù)皮多糖得率達(dá)到13.143%，比傳統(tǒng)的熱水浸提法提高超過(guò)3個(gè)百分點(diǎn)。

熱水浸提法工藝比較簡(jiǎn)單，易于操作，但是提取效率低，酶法則利用纖維素酶、果膠酶去分解植物細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的成分，對(duì)組織細(xì)胞造成破壞，從而促進(jìn)胞內(nèi)有效成分的溶出，利用復(fù)合酶輔助熱水浸提法提取榆樹(shù)皮多糖，具有提取率高等優(yōu)點(diǎn)，可為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)榆樹(shù)皮多糖提供理論依據(jù)。

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