武陵山區(qū)巴東縣地方特色自釀葡萄酒的安全性初步評價

席曉圓，張 鵬*，向振坤，白 龍，宋發(fā)軍

（中南民族大學 生命科學學院，生物技術(shù)國家民委重點實驗室 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430074）

葡萄酒是以鮮葡萄或葡萄汁為原料，經(jīng)全部或部分發(fā)酵釀制而成的，酒精度不低于7.0%vol的酒精飲品。葡萄皮中含有的白藜蘆醇對預防癌癥等有著顯著的療效[1]。葡萄酒性溫味甘，具有養(yǎng)顏護膚、抗衰抗輻射、消除疲勞、止血利尿的功效，對預防心臟病、壞血病、貧血，降低血脂等具有一定的幫助[2-3]。武陵山區(qū)野生葡萄資源豐富，當?shù)囟嘤星锛咀葬勂咸丫频牧晳T，屬于地方特色風味飲品之一。自釀葡萄酒具有方法簡單、不使用食品添加劑、價格便宜、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點，因此，頗受當?shù)孛癖姎g迎。但由于原材料葡萄和加工工藝會對自釀葡萄酒的質(zhì)量有影響（如葡萄的品種、質(zhì)量與種植環(huán)境等），因而存在一定的安全風險。因此，有必要對自釀葡萄酒的理化指標、微生物指標等進行檢測，對其飲用安全進行評價。

該文采用密度瓶法、氣相色譜法和原子吸收分光光度法等方法對自釀葡萄酒的酒精度、干浸出物、甲醇和重金屬、總酸度、總糖、菌落總數(shù)及致病菌等指標進行檢測，評價自釀葡萄酒的相關(guān)指標是否符合安全飲用標準，從而為開發(fā)武陵山區(qū)地方特色風味飲品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料葡萄酒采集自湖北省恩施州巴東縣的茶店子鎮(zhèn)店子坪村。

甲醇（色譜純）：天津光復精細化工研究所；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

真菌和細菌的分離和培養(yǎng)分別采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）和LA培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分及配制方法見文獻[4]。細菌分子鑒定采用16S rDNA引物（F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。

可溶性糖測定試劑盒：蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SP-2100A氣相色譜儀：北京北分瑞利分析儀器（集團）有限責任公司；AA-6300原子吸收分光光度計：日本島津有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒的釀制

原料葡萄挑選→清水浸泡10～30 min→葡萄捏碎（葡萄皮戳破即可）→葡萄∶糖=10∶1的比例加糖（糖分兩次添加：第一次在裝入葡萄后24 h加入，剩余的糖在3～4 d后視發(fā)酵情況加入）→密封→18～20 ℃發(fā)酵→渣液分離→過濾→后發(fā)酵大約30 d后啟封→15～20 ℃自然陳釀。

1.3.2 總酸的測定

參照文獻[5]的方法進行NaOH標液的標定及樣品總酸的測定。葡萄酒的總酸計算公式如下：

式中：X為樣品中滴定酸的含量，g/L；C為氫氧化鈉標準溶液的濃度，mol/L；V0為空白對照消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；V1為樣品滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；V2為檢測樣品體積，mL；0.075為與1.00 mL氫氧化鈉標準溶液相當?shù)囊钥吮硎镜乃岬馁|(zhì)量。

1.3.3 酒精度的測定

參照文獻[6-7]的密度瓶法進行酒精度的測定，葡萄酒餾出液在20 ℃時的密度計算公式如下：

根據(jù)酒樣蒸餾液在20 ℃時的密度，可從酒精水溶液密度與酒精度對照表（20 ℃）中查得試樣中酒精含量的體積百分數(shù)，以%vol表示。

1.3.4 總糖（以葡萄糖計）的測定

使用可溶性糖測定試劑盒進行總糖的測定。計算公式如下：

式中：A為波長620 nm條件下的吸光度值；W為取樣的體積，mL；X為總糖含量，g/L。

1.3.5 干浸出物的測定[8-9]

使用1.3.3中蒸出酒精后的殘液，在20 ℃時用水定容至100 mL。并按密度瓶法測定酒精度，分析步驟同1.3.3操作，依據(jù)密度瓶法測定酒精度的密度。由計算公式計算出脫醇樣品20 ℃時的密度ρ1，以ρ1×1.001 8的值查詢密度-總浸出物含量對照表，得出總浸出物含量，g/L。根據(jù)干浸出物=總浸出物-總糖+0.05×還原糖，得出干浸出物的含量。

1.3.6 甲醇的測定

用于檢測葡萄酒中甲醇含量的甲醇標準溶液的配制：用體積分數(shù)為60%的乙醇水溶液為溶劑，配制質(zhì)量濃度為0.1 g/L的甲醇（色譜純）標準溶液。

依據(jù)文獻[10-11]報道的方法進行樣品的制備。色譜條件：5%OV-101石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 m），載氣氮氣，流速300 mL/min，氫氣流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min，進樣量0.5 μL，柱溫50 ℃，檢測器溫度120 ℃，氣化室溫度120 ℃，分別檢測0.1 g/L的甲醇標準溶液和樣品溶液，甲醇含量的計算公式如下：

社會形態(tài)的發(fā)展是合規(guī)律性的自然歷史過程與合目的性的主體自覺選擇過程的統(tǒng)一。我國現(xiàn)階段主導性與多樣性相統(tǒng)一的社會生態(tài)化治理基本范式，也是在主客觀條件共同作用下歷史地形成的。

式中：C為樣品甲醇質(zhì)量濃度，g/L；Cs為標準品甲醇質(zhì)量濃度，g/L；A為樣品甲醇峰面積；As為標準品甲醇峰面積。

1.3.7 重金屬的測定

依據(jù)文獻[12]的方法進行自釀葡萄酒樣品的處理，并用體積分數(shù)2%的硝酸溶液配制質(zhì)量濃度分別為0、0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.6 μg/mL、0.8 μg/mL的鎘和鉛標準溶液，然后將樣品和標準溶液送至中南民族大學分析測試中心采用原子吸收分光光度法進行葡萄酒中鎘和鉛含量的檢測。

1.3.8 菌落總數(shù)的測定

依據(jù)參考文獻[13]將酒樣用無菌水分別稀釋10、100倍后，分別涂于LA和PDA平板，LA平板于37 ℃培養(yǎng)48 h，PDA平板于28 ℃培養(yǎng)72 h，觀察細菌和真菌生長的結(jié)果，并用直接計數(shù)法計數(shù)。

1.3.9 細菌的分類及鑒定

2 結(jié)果與分析

2.1 自釀葡萄酒的感官評價

自釀葡萄酒的顏色為玫瑰紅色；沒有懸浮物，清亮透明；具有純凈、怡人的果香；甜、酸、澀比較協(xié)調(diào)。

2.2 總酸的測定

雖然國家標準GB 15037—2006《葡萄酒》對葡萄酒的總酸不作要求，但葡萄酒的總酸含量會影響其口感。該文對自釀葡萄酒樣品的總酸進行檢測，結(jié)果見表1。由表1可知，其平均總酸約為5.15 g/L。

表1 自釀葡萄酒樣品的總酸測定結(jié)果Table 1 Determination results of total acidity of home-brewed wine

2.3 酒精度的測定

根據(jù)國家標準GB 15037—2006《葡萄酒》中要求的葡萄酒的酒精度不得低于7%vol，對自釀葡萄酒樣品酒精度進行檢測，結(jié)果見表2。由表2可知，酒樣餾出液在20 ℃時的密度為988.118 2 g/L，經(jīng)查酒精水溶液密度與酒精度對照表（20 ℃）得其酒精度為8.66%vol～8.68%vol，符合國家相關(guān)標準。

表2 自釀葡萄酒樣品的酒精度Table 2 Determination results of alcohol content of home-brewed wine

2.4 總糖含量

采用總糖檢測試劑盒對樣品進行檢測，結(jié)果見表3。由表3可知，自釀葡萄酒的總糖含量為24.08 g/L，根據(jù)國家標準GB 15037—2006《葡萄酒》的要求，該葡萄酒酒屬于平靜葡萄酒中的半甜葡萄酒（12.1～45.0 g/L）。

表3 葡萄酒樣品的總糖Table 3 Determination results of total sugar of home-brewed wine

2.5 干浸出物含量

根據(jù)國家標準GB 15037—2006《葡萄酒》要求，葡萄酒中干浸出物的含量≥18.0 g/L。檢測自釀葡萄酒中干浸出物的含量見表4。由表4可知，葡萄酒中干浸出物平均含量為22.42 g/L，符合國標要求。

表4 葡萄酒樣品的干浸出物Table 4 Determination results of dry extracts of home-brewed wine

2.6 甲醇含量

根據(jù)國家標準GB 15037—2006《葡萄酒》要求，葡萄酒的甲醇含量≤400 mg/L。采用氣相色譜檢測自釀葡萄酒的甲醇含量，其標準品（甲醇標準溶液）和樣品色譜見圖1。

圖1 甲醇標準品(A)與自釀葡萄酒樣品(B)的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatography of methanol standard (A) and home-brewed wine sample (B)

圖1（A）中0.890 min處的峰為甲醇。1.398 min處的峰為乙醇。其標準溶液的甲醇峰面積As為1 816 932.488，樣品峰面積A為1 843 351.736，標準溶液的甲醇質(zhì)量濃度Cs為0.1 g/L，經(jīng)方法1.3.5中公式計算得自釀葡萄酒中甲醇含量為101.45 mg/L，符合國標要求。

2.7 鎘和鉛的含量

原國家標準GB 2758—2005《發(fā)酵酒衛(wèi)生標準》規(guī)定鉛≤0.2 mg/L，而在國家標準GB 2758—2012《食品安全國家標準發(fā)酵酒及其配制酒》、國家標準GB 15037—2006《葡萄酒》中沒有規(guī)定鉛的限量指標，而且GB 2758—2012和GB 15037—2006對鎘含量沒有要求，但國際葡萄與葡萄酒組織（organisation internationale de vigne et du vin，OIV）對葡萄酒中鉛、鐵、銅、鎘、鋅、砷、鈉7種金屬含量都有要求[13]。采用原子吸收分光光度法檢測自釀葡萄酒中鎘和鉛含量的結(jié)果（表5）表明，自釀葡萄酒中鎘和鉛的含量甚微，分別為3.22 μg/L、40 μg/L，對人體健康不會造成危害。

表5 自釀葡萄酒樣品的鎘和鉛含量Table 5 The Cd or Pb content of the home-brewed wine

2.8 微生物檢測

國家標準GB 2758—2012《食品安全國家標準發(fā)酵酒及其配制酒》規(guī)定葡萄酒中的菌落總數(shù)≤50 CFU/mL。自釀葡萄酒中菌落總數(shù)的檢測結(jié)果見表6。自釀葡萄酒中沒有分離出真菌（PDA平板無真菌生長）；而1 mL自釀葡萄酒原液在37 ℃培養(yǎng)48 h的條件下，細菌菌落總數(shù)平均值為10 CFU/mL，符合GB 2758—2012標準的規(guī)定。對從4 mL葡萄酒中分離的40株細菌進行革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)均為革蘭氏陽性菌。之后，根據(jù)細菌的形態(tài)特征將其分成不同的組，并隨機選擇具有明顯差異的10株細菌進行16S rDNA序列擴增以及分析，結(jié)果（表7）表明，各有3株細菌屬于枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌，各有2株屬于蠟樣芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌；未發(fā)現(xiàn)沙門氏菌及金黃色葡萄球菌等致病菌，符合國家標準（GB 2758—2012）的要求。

表6 自釀葡萄酒樣品的細菌菌落總數(shù)Table 6 Total plate count of the home-brewed wine

表7 分離自釀葡萄酒樣品的細菌的分類Table 7 Classification of the strains isolated from the home-brewed wine

3 結(jié)論

自釀葡萄酒營養(yǎng)價值豐富且釀制方法簡單，不添加任何食品添加劑，靠葡萄自身攜帶的酵母菌自然發(fā)酵而成[15]。原材料葡萄的生長環(huán)境及自釀工藝等，會影響自釀葡萄酒質(zhì)量與安全，比如土壤環(huán)境會影響葡萄中重金屬和微生物的含量，自釀工藝會影響葡萄酒中的甲醇含量[16]，這些會導致自釀葡萄酒飲用的不安全性。

鑒于對武陵山區(qū)地方特色飲品的開發(fā)，本研究采集了當?shù)氐淖葬勂咸丫?，運用密度瓶法、氣相色譜法、原子吸收分光光度法、酸堿滴定法及微生物培養(yǎng)法對自釀葡萄酒的酒精度、干浸出物、甲醇、重金屬、總酸度、菌落總數(shù)及致病菌等指標進行了檢測，根據(jù)國際葡萄和葡萄酒組織（OIV）規(guī)定以及國家標準（GB 15037—2006、GB 2758—2012）對其安全性進行了初步的評價：酒精度、干浸出物、甲醇、總酸、菌落總數(shù)和致病菌等指標均符合相關(guān)標準。并根據(jù)該葡萄酒中總糖的含量，將該葡萄酒劃分為平靜葡萄酒中的半甜葡萄酒。結(jié)果表明，武陵山區(qū)茶店子鎮(zhèn)的自釀葡萄酒色澤紅艷清亮、香甜怡人、酸澀比較協(xié)調(diào)，檢測指標均符合相關(guān)標準，可作為一項飲用安全的具有開發(fā)潛力的地方特色飲品。

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