傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中產蛋白酶菌株的篩選

孫曉東，呂國忠 *，欒雨時，陳 嶸，趙志慧

（1.大連理工大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024；2.大連民族大學環(huán)境與資源學院，遼寧 大連 116600；3.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116600）

豆醬也稱黃豆醬或大豆醬，在我國北方地區(qū)俗稱大醬，是中國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，距今已有超過3 000年的歷史[1]。發(fā)酵豆醬保留了大豆本身的營養(yǎng)成分，增加了蛋白質的含量，消除了胰蛋白酶抑制劑，并將大豆蛋白進一步分解成人體所能直接吸收利用的小肽[2]，使得豆醬成為營養(yǎng)豐富、口味獨特、易于消化吸收的調味品。由于傳統(tǒng)的家庭自制豆醬是自然發(fā)酵而成，在完全開放式的制作過程中，空氣中的大量微生物自由落入，形成特殊的微生物區(qū)系，其中真菌伴隨在豆醬的整個制作過程，米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）等有益菌分解大豆蛋白，形成豆醬特有的風味和營養(yǎng)[3]。

微生物蛋白酶是一類由微生物分泌到胞外用于降解一些難以利用的營養(yǎng)物質的蛋白水解酶，目前應用于干酪生產、肉類嫩化和植物蛋白改性等方面。在其的作用下，人體內攝入的蛋白被水解成小分子肽和氨基酸[4]，如曲霉和毛霉是發(fā)酵食品生產中應用最為廣泛的發(fā)酵菌種[5]。本研究對254份采自東三省各地的家庭自制豆醬進行分離，獲得純培養(yǎng)真菌菌株389株，并用形態(tài)學分類將其鑒定到種[6-12]，明確了各菌株的分類地位。對這些菌株進行了蛋白酶活性的篩選，通過平板透明圈法[13]、發(fā)酵復篩等獲得高產蛋白酶的菌株，并對其蛋白酶活性進行了測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1%牛奶瓊脂培養(yǎng)基：10 g脫脂牛奶，20 g瓊脂，加水定容至1 000 mL，pH值自然；復篩培養(yǎng)基：煮熟大豆20 g，pH值自然；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

自然發(fā)酵豆醬：東三省各地的農戶家；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、福林酚試劑（分析純）：上海索萊寶生物科技有限公司；酪氨酸：上海酶聯(lián)生物科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

奧林帕斯CX21顯微鏡：日本奧林帕斯株式會社；Sigma2-16KL離心機：德國Sigma公司；HZQ-Q全溫振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；FA2004型電子天平：上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

用接種針將保存于凍存管里的各供試菌株接入新鮮的PDA平板中，25 ℃黑暗培養(yǎng)，待長出菌落后進行菌株的初篩。

1.3.2 產蛋白酶菌株的初篩

采用平板透明圈法進行菌株初篩。在直徑9 cm的無菌培養(yǎng)皿中，注入15 mL脫脂牛奶培養(yǎng)基，待凝固成平板后，挑取單菌落接種于平板上，置25 ℃黑暗培養(yǎng)。記錄透明圈半徑，選取形成透明圈的菌株進行復篩的發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3.3 發(fā)酵復篩

取煮熟的大豆20 g，置于150 mL三角瓶中，滅菌。將新鮮菌株制成濃度為1×106CFU/mL的菌懸液，取1 mL置于滅菌的大豆中，于25 ℃黑暗培養(yǎng)15 d。

1.3.4 酶液的制備

將發(fā)酵15 d的大豆三角瓶從培養(yǎng)箱中取出，加入50 mL無菌的去離子水，分散均勻，30 ℃振蕩培養(yǎng)4 h，靜置。濾液4 200 r/min離心20 min，取上清液作為粗酶液測定。

1.3.5 標準曲線的制作

采用福林酚法測定蛋白酶的活性。首先配制不同質量濃度的酪氨酸標準液，如表1所示。分別取不同質量濃度酪氨酸1 mL，各加入0.4 mol/L碳酸鈉5 mL，Folin試劑工作液1 mL，搖勻置于水浴鍋中，40 ℃保溫發(fā)色20 min，用分光光度計在波長680 nm處測定吸光度值[14]。以吸光度值（y）為縱坐標，酪氨酸質量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線。

表1 不同質量濃度酪氨酸溶液的配制Table 1 Preparation of different concentration of tyrosine

1.3.6 蛋白酶活性測定

酶活定義：在一定pH值和40 ℃條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需的酶量定義為一個蛋白酶活力單位，U。每個樣品做3個平行試驗，取平均值計算酶活力。計算公式如下：

式中：U為樣品的酶活力，μg/mL；C為由標準曲線得到的酪氨酸溶液的質量濃度，μg/mL；N為酶液的稀釋倍數；4為反應試劑總體積，mL；10為反應時間，min；V為酶液的總體積，mL。

反應過程如下[14]：

從反應過程可以看出，樣品和空白管中，酪蛋白和三氯乙酸（TCA）的加入順序不同，前者酪蛋白與待測酶液充分反應，而后者先加入的TCA阻止了酶液和酪蛋白的反應。

2 結果與分析

2.1 酪氨酸標準曲線

繪制酪氨酸標準曲線如圖1所示，并得回歸方程：y=0.009 5x+0.000 8，其中y為吸光度值（OD680nm），x為酪氨酸質量濃度。相關系數R2=0.996 9，表明二者線性關系良好。

圖1 酪氨酸的標準曲線Fig.1 Standard curve of tyrosine

2.2 產蛋白酶菌株的篩選結果

將分離自豆醬的389株真菌進行脫脂牛奶平板透明圈法初篩，其中共有31株表現出蛋白酶活性，在培養(yǎng)基的背面形成了透明的水解圈。用福林酚法測定發(fā)酵復篩后的粗酶液，各菌株都表現出了不同程度的蛋白酶活性。各菌株的透明圈大小及酶活詳見表2。

表2 各菌株的透明圈大小及酶活力Table 2 The transparent zone diameter and protease activity of the stains

由表2可以看出，從豆醬上分離到的多種真菌都具有合成蛋白酶的能力，編號為JMHKA和JYSA的菌株蛋白酶活性遠遠高于其他菌株，這兩株菌是分別采自吉林梅河口和吉林榆樹的米曲霉。米曲霉是公認的食品安全菌株，具有很強的蛋白酶合成能力，其蛋白酶在較廣的pH 范圍內均具有活性，另外由于米曲霉含有豐富的糖苷水解酶，可以利用淀粉或纖維素等廉價原料高效生產蛋白酶，所以米曲霉是食品用蛋白酶的主要來源菌株[15]。這兩株高酶活的米曲霉可以用于后續(xù)的蛋白酶的分離純化，及酶學性質的研究。

表2中還有4株真菌在脫脂牛奶平板上產生了透明圈，表現出了蛋白酶活性，可在后續(xù)的發(fā)酵培養(yǎng)中，粗酶液的酶活為負值。這種現象出現的原因，可能為福林酚法測酶活時，酶液與酪蛋白作用出現了問題，或者發(fā)酵培養(yǎng)的條件不適合菌株的生長，使菌株出現了生長停滯或者代謝遲緩等問題。

3 結論

試驗測得的透明圈大小與粗酶液的酶活力并不完全成正相關，究其原因，可能為脫脂牛奶平板的營養(yǎng)狀況和培養(yǎng)條件并不是某些菌株適宜的生長條件，因此出現了透明圈半徑小，而發(fā)酵液酶活大的情況。由此可以得出，如果僅僅依靠初篩的透明圈半徑來篩選強酶活的菌株是不精準的，建議對產生透明圈的菌株都應該進行復篩發(fā)酵。

用脫脂牛奶平板對分離到的389株真菌進行蛋白酶活性的初篩，得到了31株產生透明水解圈的菌株，其中曲霉屬的真菌12株、青霉5株、毛霉4株、鐮孢菌3株、帚霉1株、芽枝孢3株、犁頭霉1株、紅曲2株。曲霉屬的真菌無論從數量還是酶活都遠遠高于其他屬的真菌，是豆醬發(fā)酵過程中分解大豆蛋白的主要功能菌株。其他屬的真菌也具有或高或低的蛋白酶合成能力，在豆醬的發(fā)酵中應該是多菌株混合發(fā)酵，相互協(xié)同，共同將大豆蛋白降解。

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