綠色木霉與黑曲霉混合發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的研究

姜伯玲，王曙陽 *，李文建，董妙音，陳積紅，劉 敬，胡 偉

（1. 中國科學(xué)院近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

纖維素酶是一類能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，它們協(xié)同作用，分解纖維素產(chǎn)生寡糖和纖維二糖，最終水解為葡萄糖[1-2]。一般按照其催化功能可分為3大類：外切-β-1,4-葡聚糖酶（exo-l,4-β-D-glucanase，CBH）E.C.3.2.1.4、內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶（endo-1,4-β-D-glucanase，EG）E.C.3.2.1.91及β-葡萄糖苷酶（β-D-1,4-glucosidase，β-GA）E.C.3.2.1.21。天然纖維的組成和結(jié)構(gòu)不同，3種酶必須同時參與才能將纖維素晶體降解為簡單糖類[3-5]。

目前，纖維素酶在食品、紡織、畜牧業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、生物質(zhì)能源開發(fā)及工農(nóng)業(yè)廢棄物回收等方面已廣泛應(yīng)用[6-8]，市場對纖維素酶的需求量日益增加。能分泌纖維素酶的微生物是纖維素酶的主要來源，主要有真菌、細菌、放線菌和一些原生動物等[9-10]。真菌類的木霉屬（Trichoderma）、曲霉屬（Aspergillus）能產(chǎn)生3類纖維素酶且是胞外酶，降解纖維素的能力較強，因此是人們研究纖維素酶的熱點領(lǐng)域。但應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)，單菌發(fā)酵所產(chǎn)的纖維素酶存在酶系不完整和個別酶活低的缺陷，如綠色木霉及其近緣菌株發(fā)酵產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶活力較高，但所產(chǎn)的纖維素酶中普遍存在β-葡萄糖苷酶（β-GA）活力低的缺陷，而黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力較高，產(chǎn)內(nèi)切和外切葡聚糖酶能力較低[11-13]。纖維素酶活高低是影響纖維素酶降解纖維素能力的一個重要指標，而纖維素酶系組分配比的合理性也是不可忽視的一個影響因素。DUFF S J B等[14-15]報道，β-GA與濾紙酶活力（filter paper activity，F(xiàn)PA）的比值在0.12～1.50范圍內(nèi)時，纖維素酶系完整，組分配比合理，可以有效降解天然纖維素。因此，開發(fā)產(chǎn)纖維素酶活高、酶系全、酶組分配比合理的多菌混合發(fā)酵在降低纖維素酶生產(chǎn)成本、提高纖維素酶降解能力等方面有重要意義[16]。

本研究利用綠色木霉與黑曲霉混合發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，研究了綠色木霉與黑曲霉單獨發(fā)酵及混合發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶酶活的特點，優(yōu)化黑曲霉的接種時間及混合發(fā)酵時間，使混合發(fā)酵所產(chǎn)纖維素酶系完整、降解纖維素能力增強，從而降低生產(chǎn)成本，利于工業(yè)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

綠色木霉（Trichoderma viride）GSTCC 62010（NM01）、黑曲霉（Aspergillus niger）GSTCC 60108（NH01）：甘肅省微生物菌種保藏中心；綠色木霉NMy及黑曲霉NHy由綠色木霉NM01、黑曲霉NH01混合發(fā)酵選育得到；黑曲霉NH11-1是黑曲霉NH01通過重離子輻照選育得到；選育得到的菌株均保存于中國科學(xué)院近代物理研究所微生物實驗室。

1.1.2 主要試劑

羧甲基纖維素鈉（carboxymethylatedcellulose，CMC-Na）：天津市北辰方正試劑廠；微晶纖維素、水楊苷：加拿大Bio Basic股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：上海中秦化學(xué)試劑有限公司；瓊脂：北京索萊寶科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，蔗糖20 g，水1 000 mL，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

（2）種子培養(yǎng)基：CMC-Na 7.5 g，蛋白胨5.0 g，吐溫-80 2.0 mL，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl20.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g，MnSO4·H2O 0.001 6 g，ZnSO4·7H2O 0.001 4 g，CoCl20.002 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 7.5 g，吐溫-80 2.0 mL，（NH4）2SO41.4g，K2HPO42.0g，MgSO4·7H2O0.3g，CaCl20.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g，MnSO4·H2O 0.001 6 g，ZnSO4·7H2O 0.001 4 g，CoCl20.002 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-756PC型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；HZQ-X300型恒溫振蕩器、DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機：湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 綠色木霉和黑曲霉單獨發(fā)酵培養(yǎng)方法

將4 ℃冰箱保存的綠色木霉NM01、NMy與黑曲霉NHy、NH11-1分別接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，用無菌生理鹽水洗下斜面孢子，利用血球計數(shù)板計數(shù)，控制孢子濃度為1×107個/mL，接種孢子懸液于種子培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。將種子培養(yǎng)基按5%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，取發(fā)酵液待測。

1.3.2 綠色木霉與黑曲霉混合發(fā)酵培養(yǎng)方法

將1.3.1中的種子培養(yǎng)基按綠色木霉NM01∶黑曲霉（NHy、NH11-1）=5∶1（V/V）的接種比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，使綠色木霉NM01分別與黑曲霉NHy、NH11-1進行混合發(fā)酵，30 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5 d，取發(fā)酵液待測。

1.3.3 混合發(fā)酵中黑曲霉NH11-1接種時間的優(yōu)化

將1.3.1中的綠色木霉NM01種子培養(yǎng)基按5%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，黑曲霉NH11-1種子培養(yǎng)基分別推遲24 h、48 h、72 h接種至綠色木霉NM01發(fā)酵培養(yǎng)基中，綠色木霉NM01與黑曲霉NH11-1的接種比例仍為5∶1（V/V），30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，取發(fā)酵液待測。

1.3.4 纖維素酶活力和β-GA的測定

發(fā)酵液在20 ℃、4 000 r/min下離心10 min，取上清液即得粗酶液。FPA與β-GA的測定見參考文獻[17]。一個濾紙酶活力和一個β-葡萄糖苷酶活力單位均定義為：在標準反應(yīng)條件下每分鐘生成1 μg葡萄糖所需的酶量（U/mL）。

1.3.5 總還原糖含量的測定

還原糖含量采用DNS方法進行測定，1.3.4中得到的粗酶液與相應(yīng)底物反應(yīng)后，添加3 mL DNS溶液，沸水浴中反應(yīng)5 min，冷卻至室溫后，于波長520 nm處檢測其吸光度值，根據(jù)葡萄糖標準曲線回歸方程計算還原糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠色木霉、黑曲霉單獨發(fā)酵培養(yǎng)對產(chǎn)纖維素酶活的影響

綠色木霉NM01、NMy及黑曲霉NH11-1、NHy單獨發(fā)酵5 d時，取樣進行FPA與β-GA的檢測，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，綠色木霉NM01的FPA（204.60 U/mL）極顯著（P＜0.01）高于其他3個菌株；而黑曲霉NH11-1及NHy的β-GA分別為339.38 U/mL、333.67 U/mL，極顯著（P＜0.01）高于2株綠色木霉，而黑曲霉NH11-1的β-GA（339.38 U/mL）與NHy1的β-GA（333.67 U/mL）之間沒有顯著差異，這符合黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的特點，即黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力較強，但是產(chǎn)外切葡聚糖酶的能力較弱，致使纖維素酶的總體酶活不高；而綠色木霉存在β-葡萄糖苷酶酶活較低的缺陷，使得其所產(chǎn)的纖維素酶酶系結(jié)構(gòu)不合理。此結(jié)果可作為混合發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的依據(jù)，即將FPA較高的綠色木霉NM01分別與β-GA較高的黑曲霉NH11-1及NHy進行混合發(fā)酵。

圖1 綠色木霉、黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)對產(chǎn)纖維素酶酶活的影響Fig.1 Effect of fermentation by Aspergillus niger and Trichoderma viride on cellulase activities

2.2 菌株混合發(fā)酵培養(yǎng)對產(chǎn)纖維素酶酶活的影響

綠色木霉NM01分別與黑曲霉NH11-1、NHy混合（5∶1）發(fā)酵培養(yǎng)對產(chǎn)纖維素酶酶活的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 兩菌株混合發(fā)酵培養(yǎng)對產(chǎn)纖維素酶酶活的影響Fig.2 Effect of mixed-culture fermentation by Aspergillus niger and Trichoderma viride on cellulase activities

由圖2可知，綠色木霉NM01與黑曲霉NH11-1混合發(fā)酵的FPA與β-GA分別為239.59 U/mL和512.88 U/mL，2種酶活極顯著（P＜0.01）高于綠色木霉NM01與黑曲霉NHy混合發(fā)酵的FPA與β-GA相應(yīng)酶活（65.82 U/mL，130.06 U/mL）。與綠色木霉NM01、黑曲霉NH11-1及NHy單獨發(fā)酵相比混合發(fā)酵產(chǎn)β-GA效果具有明顯優(yōu)勢，而所產(chǎn)的FPA沒有明顯提高。綠色木霉NM01與黑曲霉NH11-1混合發(fā)酵所產(chǎn)纖維素酶中β-GA與FPA的比值為2.14，超出0.12～1.50的范圍，所以需要對黑曲霉NH11-1的接種時間進行優(yōu)化，控制其所產(chǎn)纖維素酶活的大小，從而使β-GA與FPA的比值在0.12～1.50范圍內(nèi)。

2.3 混合發(fā)酵中黑曲霉NH11-1接種時間的優(yōu)化

β-GA與FPA的比值在0.12～1.50范圍內(nèi)時，纖維素酶水解纖維素的能力較強，而且針對不同的底物有最適的比值。從理論上來講，β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖，從而減弱纖維二糖對酶解過程的抑制，提高酶解效率，所以在范圍內(nèi)其比值較大時酶解效果較好。黑曲霉NH11-1延遲接種時間對產(chǎn)纖維素酶酶活的影響結(jié)果見表1。

表1 黑曲霉NH11-1延遲接種時間對產(chǎn)纖維素酶酶活的影響Table 1 Effect of delayed inoculation time of Aspergillus niger NH11-1 on cellulase activities

由表1可知，以綠色木霉NM01和黑曲霉NH11-1單獨發(fā)酵作為對照，當黑曲霉NH11-1與綠色木霉NM01混合接入培養(yǎng)基時，所得到的β-GA均明顯高于綠色木霉NM01和黑曲霉NH11-1單獨發(fā)酵所得到β-GA（153.19 U/mL、339.38 U/mL），但所得到的FPA沒有明顯高于綠色木霉NM01單獨發(fā)酵所得到的FPA（204.60 U/mL）。說明黑曲霉NH11-1與綠色木霉NM01混合接種進行發(fā)酵時以黑曲霉NH11-1產(chǎn)β-葡萄糖苷酶為主，以綠色木霉NM01產(chǎn)纖維素酶為輔，而且β-GA與FPA的比值為2.14，超出0.12～1.50的范圍，即此時纖維素酶對天然纖維素的降解能力不是很強。

黑曲霉NH11-1推遲24 h接種后發(fā)酵第5天的FPA最低（101.61U/mL），β-GA與FPA的比值為2.86，即黑曲霉NH11-1與綠色木霉NM01之間未形成協(xié)同作用，而是成了綠色木霉NM01產(chǎn)纖維素酶的干擾因素。黑曲霉NH11-1推遲72 h接種的β-GA與FPA的比值為1.51，說明以黑曲霉NH11-1產(chǎn)β-GA為主，其β-GA與FPA的比值與推遲24 h接種的混合發(fā)酵組均超出0.12～1.50的范圍，即纖維素酶系不滿足水解纖維素的最佳條件。

黑曲霉NH11-1推遲48 h接種后發(fā)酵第5天的β-GA與FPA的比值為1.22，表明纖維素酶系完整，纖維素酶各組分配比合理，且FPA和β-GA較高，滿足其對纖維素進行完全水解的條件，說明此過程以綠色木霉產(chǎn)纖維素酶為主，而黑曲霉NH11-1起輔助協(xié)同作用。此結(jié)果不同于高星星等的報道[18]，即黑曲霉推遲接種48 h與里氏木霉混合發(fā)酵產(chǎn)酶效果最佳，可能與所使用菌種、培養(yǎng)基碳源等條件有關(guān)。

2.4 發(fā)酵時間對混合發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶酶活的影響

黑曲霉NH11-1推遲48 h接種與綠色木霉NM01混合發(fā)酵時間對產(chǎn)纖維素酶酶活的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵時間對混合發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶酶活的影響Fig.3 Effect of mixed-culture fermentation time on cellulase activity

由圖3可知，在混合發(fā)酵第2～4天，F(xiàn)PA顯著下降，β-GA呈上升趨勢，說明黑曲霉NH11-1接種至綠色木霉NM01發(fā)酵瓶中后在初始階段迅速生長，在發(fā)酵體系中以黑曲霉NH11-1產(chǎn)β-GA為主，綠色木霉NM01產(chǎn)纖維素酶為輔。發(fā)酵第4～6天FPA開始逐漸上升，β-GA仍呈上升趨勢，說明此過程主要是綠色木霉NM01產(chǎn)纖維素酶，而黑曲霉NH11-1起輔助協(xié)同作用。綠色木霉NM01與黑曲霉NH11-1二者互利共生，綠色木霉產(chǎn)生大量的內(nèi)切和外切葡聚糖酶，催化發(fā)酵培養(yǎng)基中的纖維素類底物產(chǎn)生大量纖維二糖，纖維二糖進一步誘導(dǎo)黑曲霉NH11-1生成大量β-GA，有效降解纖維二糖生成葡萄糖，供給綠色木霉NM01與黑曲霉NH11-1利用。在發(fā)酵第5天與第6天β-GA與FPA的比值分別為1.22、1.10，說明纖維素酶組分配比合理，同時纖維素酶活均較高，均滿足降解纖維素的條件，但考慮到發(fā)酵的經(jīng)濟性，因此，選取發(fā)酵周期為5 d。

3 結(jié)論

與綠色木霉、黑曲霉單一培養(yǎng)相比，黑曲霉NH11-1與綠色木霉NM01混合發(fā)酵在產(chǎn)纖維素酶方面具有明顯優(yōu)勢，二者可以兼容并發(fā)揮協(xié)同作用，改善纖維素酶的組分配比，并提高纖維素酶總體酶活。結(jié)果表明，黑曲霉NH11-1推遲48 h接種至綠色木霉NM01發(fā)酵瓶中進行混合發(fā)酵的產(chǎn)酶效果最佳，30 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5 d，F(xiàn)PA達到242.80 U/mL，是出發(fā)菌黑曲霉NH11-1的2.66倍；β-GA達到297.35 U/mL，是出發(fā)菌綠色木霉NM01的1.94倍；β-GA與FPA的比值為1.22，符合纖維素酶水解天然纖維素的最佳比例范圍。

結(jié)果表明，綠色木霉NM01與黑曲霉NH11-1在同一發(fā)酵體系中二者可以兼容并發(fā)揮協(xié)同作用，可以改善纖維素酶的組分配比，并提高纖維素酶總體酶活，即混合發(fā)酵具有良好的大規(guī)模產(chǎn)纖維素酶的工業(yè)應(yīng)用前景。

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