他拉達(dá)非對(duì)肺動(dòng)脈高壓模型大鼠降鈣素基因相關(guān)肽、p27及 p-ERK1／2表達(dá)的影響

姜波

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科，山東 濟(jì)寧 272000）

他拉達(dá)非對(duì)肺動(dòng)脈高壓模型大鼠降鈣素基因相關(guān)肽、p27及 p-ERK1／2表達(dá)的影響

姜波

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科，山東 濟(jì)寧 272000）

目的 分析他拉達(dá)非對(duì)肺動(dòng)脈高壓模型大鼠降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、p27及p-ERK1／2表達(dá)的影響。方法 將36只雄性SD大鼠隨機(jī)分為肺動(dòng)脈高壓（PAH）組（A組），他拉達(dá)非組（B組）及對(duì)照組（C組），各12例。觀察各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)及肺血管形態(tài)學(xué)變化，以Western Blot法分析肺動(dòng)脈CGRP，p27及p-ERK1／2的表達(dá)。結(jié)果 與A組比，B組聚天冬氨酸（PASP）、平均肺動(dòng)脈壓（mPAP）顯著降低(P＜0.05)，游離右室壁（RV）／（左室+室間隔）（LV+S）在 A，B組間無顯著性差異（P＞0.05），但均顯著高于 C組(P＜0.05)；A組右心室肥大程度及肺血管結(jié)構(gòu)變化顯著高于B組(P＜0.05)，且均顯著高于C組(P＜0.05)；A組大鼠CGRP，p27表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，p-ERK1／2表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)，經(jīng)他拉達(dá)非干預(yù)后改善，但與C組相比，差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 他拉達(dá)非能顯著改善PAH模型大鼠的血管重構(gòu)，CGRP及ERK1／2／p27在其中可能扮有重要作用。

他拉達(dá)非；肺動(dòng)脈高壓；降鈣素基因相關(guān)肽；血管重構(gòu)

肺動(dòng)脈高壓（PAH）是以平滑肌細(xì)胞增生、肺血管收縮及重構(gòu)為特征的疾病，能引起患者右心室肥厚、肺血管阻力增加最終導(dǎo)致患者右心衰竭和死亡。近年的研究顯示，血管重構(gòu)是PAH發(fā)生和發(fā)展的重要病理生理機(jī)制，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的過度增殖與遷移是引起血管重構(gòu)的關(guān)鍵因素[1]。降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）是感覺神經(jīng)的重要遞質(zhì)，是目前已知最強(qiáng)的舒血管物質(zhì)，在調(diào)節(jié)血管阻力和維持血壓穩(wěn)定等方面有重要作用[2]，而p27及ERK1／2參與的信號(hào)通路在調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖及血管重構(gòu)方面亦有重要作用。他達(dá)拉非為5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑，廣泛應(yīng)用于治療肺動(dòng)脈高壓，但其作用機(jī)制尚未完全明了。本研究中基于CGRP具有降壓及抑制血管重構(gòu)的作用，探討了 CGRP及ERK1／2／p27在他達(dá)拉非降低肺動(dòng)脈高壓、預(yù)防緩解肺血管重構(gòu)中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：Model680型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；BL-410型多功能生理記錄儀（成都泰盟科技有限公司）；Mini PROTEAN電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

試藥：鹽酸他達(dá)拉非片（美國(guó) Elilillyand公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20120472，規(guī)格為每片 20 mg)，藥片粉碎后溶于 10 mL生理鹽水備用；野百合堿（MCT，Sigma公司，批號(hào)為063K1183)，溶于1 mol／L稀 HCl溶液，制成1% 濃度溶液，調(diào)pH至7.2，加生理鹽水配制成10 g／L MCT溶液。兔抗鼠CGRP多克隆抗體（美國(guó)Sigma公司）；小鼠抗大鼠p27單克隆抗體、小鼠抗大鼠ERK1／2單克隆抗體、小鼠抗大鼠p-ERK1／2單克隆抗體、小鼠抗大鼠GADPH單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）。

動(dòng)物：36只健康雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重180～200 g，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)SCXK（粵）2011-0015。動(dòng)物飼養(yǎng)及所有操作流程均遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，可自由進(jìn)食及飲水。

1.2 方法

動(dòng)物模型建立：適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，將36只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組12只，A組為MCT誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓（PAH）組，B組為他達(dá)拉非組，C組為對(duì)照組。A組、B組大鼠給予皮下注射已配制好的MCT溶液60 mg／kg，C組給予腹部注射相應(yīng)劑量生理鹽水，相同條件下喂養(yǎng)，自由飲食、飲水。4周后，動(dòng)物模型經(jīng)胸體彩超鑒定后，B組大鼠給予0.5 mg／(kg·d)他達(dá)拉非溶液灌胃處理，A組、C組給予相同劑量生理鹽水灌胃處理，相同條件飼養(yǎng)4周后，取材進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

血流動(dòng)力學(xué)及右心室肥厚病變分析：試驗(yàn)中大鼠水合氯醛腹腔麻醉后將右心導(dǎo)管預(yù)充肝素鹽水后與壓力換能器相連，用20號(hào)套管針經(jīng)右心室穿刺至肺動(dòng)脈主干記錄肺動(dòng)脈收縮壓（PASP）及平均肺動(dòng)脈壓（mPAP）；處死大鼠，結(jié)扎主動(dòng)脈，取心、肺，經(jīng)生理鹽水漂洗后結(jié)扎肺動(dòng)脈，分離心臟，秤取游離右室壁和左室+室間隔質(zhì)量（RV，LV+S），計(jì)算右心肥厚指數(shù)RV／(LV+S)。

肺血管形態(tài)學(xué)觀察：石蠟包埋固定并切片，將切片經(jīng)HE染色后置于顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取直徑50～150 μm肺小動(dòng)脈標(biāo)本，用圖像分析技術(shù)計(jì)算肺血管內(nèi)外管徑均值，管壁厚度(WT)，膜厚度占管腔比例(WT，%)=2×WT／ED，管壁橫截面面積占管腔面積的比例(WA，%)=（TA-IA）／TA。

Western Blot法分析 CGRP，p27及 ERK1／2表達(dá)水平：在液氮中將肺動(dòng)脈研磨成粉末加200 μL裂解液（50 mmol／L Tris-HCl pH=8.0，150 mmol／L PMSF，0.1%NP-40，蛋白酶抑制劑）。4℃12 000 r／min離心 15 min，取上清，采用 Bradford法檢測(cè)蛋白濃度；取上述制備的蛋白樣品50 μg上樣到15%SDS-PAGE凝膠，電泳完畢后將蛋白電轉(zhuǎn)至NC膜，用5%脫脂奶粉封閉，分別加一抗，37℃孵育2 h，經(jīng)0.1%TBST漂洗后加二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜后加ECL，X線膠片定影，掃描后用IPP 6.0進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

結(jié)果見表1和表2，圖1和圖2。

表1 3組大鼠血流動(dòng)力學(xué)及右心肥厚指數(shù)比較（±s，n=12）

表1 3組大鼠血流動(dòng)力學(xué)及右心肥厚指數(shù)比較（±s，n=12）

組別A組B組C組PASP（mmHg）39.06±6.61β＃31.04±4.02β27.96±3.07 mPAP（mmHg）24.16±2.39β＃20.11±2.06β12.92±1.71 RV／（LV+S）（%）44.28±5.34β34.92±6.11β28.14±5.96

注：與C組比較，βP＜0.05；與B組比較，＃P＜0.05。下表同。

表2 3組大鼠肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)變化比較（±s，n=12）

表2 3組大鼠肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)變化比較（±s，n=12）

組別A組B組C組WT(%) 36.51±6.04β＃26.91±5.17β18.06±3.26 WA(%) 56.71±5.28β＃41.64±4.63β28.53±4.17

圖1 3組大鼠肺血管形態(tài)圖（HE，×200）

3 討論

PAH是指累及肺小動(dòng)脈且以平滑肌與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增生為特點(diǎn)的一種肺血管疾病，隨著疾病的發(fā)展，可導(dǎo)致患者右心室壓力增大，出現(xiàn)擴(kuò)張、肥大，心室對(duì)血液動(dòng)力壓力反應(yīng)減弱[3]，最終導(dǎo)致患者右心衰竭死亡。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)剪切力、缺氧、炎癥及藥物刺激能使肺血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能及代謝發(fā)生紊亂，啟動(dòng) PAH的發(fā)生[4]。血管內(nèi)皮損傷破壞了其屏障作用，干擾了平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的內(nèi)皮-肌連接作用，促進(jìn)肺血管平滑細(xì)胞過度增殖，引發(fā)肺血管重構(gòu)[5]。而在肺血管重構(gòu)的過程中細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)因子在其中發(fā)揮重要的作用，p27作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的負(fù)調(diào)節(jié)因子，能通過抑制 cyclin／CDK復(fù)合物的磷酸化，降低其活性，阻止細(xì)胞過度增殖。動(dòng)物試驗(yàn)研究[6]顯示，激活 ERK1／2信號(hào)通路可促進(jìn) p27的降解，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增殖周期。Qin等[7]的研究結(jié)果顯示，在肺動(dòng)脈平滑肌及細(xì)胞中CGRP能顯著抑制血管緊張素Ⅱ的表達(dá)，而ERK1／2在此過程中被激活。

圖2 Western Blot法分析各組CGRP，p27及ERK1／2表達(dá)

目前，PAH治療的選擇一般包括藥物治療、介入及外科治療，其中藥物治療包括鈣離子拮抗劑、內(nèi)皮素受體拮抗劑等肺動(dòng)脈血管擴(kuò)張劑，通過阻斷肺動(dòng)脈高壓發(fā)病的不同環(huán)節(jié)起作用，取得了較好的療效。但介入及外科治療，包括肺移植、心肺聯(lián)合移植及經(jīng)皮球囊房間隔造口術(shù)，手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大，術(shù)后并發(fā)癥多[8]。他達(dá)拉非為新型長(zhǎng)效、具有選擇性的磷酸二酯酶抑制劑，具有較好的耐受性，能長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)張血管，提高運(yùn)動(dòng)耐量，降低惡化發(fā)生率，可顯著改善患者的生活質(zhì)量[9]。

本研究中，采用野百合堿建模，且后期對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)變化及右心肥厚指標(biāo)分析，結(jié)果顯示PAH模型組RVSP及mPAP顯著增高，他拉達(dá)非干預(yù)后下降但仍高于對(duì)照組，提示采用野百合堿造模成功。RV／（LV+S）在模型組和干預(yù)組無顯著性差異，但均顯著高于對(duì)照組，提示造模過程大鼠已經(jīng)出現(xiàn)右心結(jié)構(gòu)異常。光鏡下模型組肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞重癥脫落，管腔不規(guī)則增厚，狹窄甚至閉塞，管腔內(nèi)殘留大量紅細(xì)胞，肺泡腔內(nèi)見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。WA及WT%結(jié)果提示，經(jīng)他拉達(dá)非干預(yù)后，肺小血管重構(gòu)得到改善。Western Blot法分析結(jié)果證實(shí)，A組CGRP，p27顯著降低，而 p-ERK1／2表達(dá)顯著升高，與 Zhang等[10]的研究結(jié)果一致，內(nèi)源性CGRP的消耗能加重PAH血管重構(gòu)，其作用機(jī)制可能與抑制ERK1／2磷酸化，進(jìn)而上調(diào)p27的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，他拉達(dá)非能顯著改善PAH模型大鼠的血管重構(gòu)，CGRP、p27及ERK1／2在其中可能具有重要作用。

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Expression of CGRP,p27 and p-ERK1／2 in Tadalafil-Intervened Pulmonary Arterial Remodeling Rats

Jiang Bo
(Department of Thoracic Surgery,Affiliated Hospital to Jining Medical College,Jining,Shandong,China 272000)

Objective To analyze the expression of CGRP,p27 and p-ERK1／2 in Tadalafil-intervention pulmonary arterial remodeling rats.M ethods 36 male SD rats were randomly divided into PAH model group(A),Tadalafil-intervention group(B)and control group (C),the blood flow dynamics and rats pulmonary vascular morphology change were observed,the expressions of pulmonary CGRP,p27 and p-ERK1／2 were analyzed.Results Compared with model group,the intervention group PASP,mPAP significantly reduced(P＜0.05),RV／(LV+S)had no significant difference(P＞0.05),but both were higher than control group(P＜0.05);the model rats right ventricular hypertrophy and pulmonary vascular structural changes was significantly higher than the intervention group(P＜0.05); CGRP,p27 expression in model group was significantly reduced,p-ERK1／2 expression significantly increased(P＜0.05),after Tadalafl intervention significantly improved,but also has a significant difference with control group(P＜0.05).Conclusion Tadalafil significantly improve PAH model rat vascular remodeling,CGRP,ERK1／2／p27 may play an important role.

tadalafil;pulmonary hypertension;CGRP;ERK1／2

R965；R972+.4

A

1006-4931(2015)23-0027-03

姜波，大學(xué)本科，主治醫(yī)師，主要從事胸外科工作，（電子信箱）bojiang1214＠163.com。

2015－07－23)