內(nèi)源蛋白酶對(duì)肉類食品風(fēng)味的影響*

李琳，王正全，張晶晶，苗曉丹，馬壘，王錫昌，劉源

1(上海海洋大學(xué)，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)

風(fēng)味是肉類食品的最重要食用品質(zhì)之一，在肉類食品的貯存和加工過程中，內(nèi)源蛋白酶對(duì)風(fēng)味的形成發(fā)揮了重要作用。蛋白質(zhì)在組織蛋白酶和鈣中性蛋白酶的作用下分解為多肽，多肽在肽酶的作用下分解為小肽，小肽在氨肽酶的作用下分解為游離氨基酸［1］。小肽與氨基酸即可作為肉類食品的特征滋味物質(zhì)，也可作為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的前體物，參與美拉德反應(yīng)和Strecker降解產(chǎn)生肉香前體物質(zhì)而形成肉的特征香氣［2］。蛋白質(zhì)的水解程度過低會(huì)使得肉類食品缺乏應(yīng)有的香氣和滋味，而蛋白質(zhì)的水解程度過度則會(huì)導(dǎo)致肉類食品軟化，產(chǎn)生不良風(fēng)味使得消費(fèi)者難以接受甚至還會(huì)影響消費(fèi)者的健康［3］。在一些肉類食品如干腌火腿加工與貯存過程中內(nèi)源蛋白酶的活力變化已有報(bào)道，但是其與風(fēng)味化合物之間的作用方式作用機(jī)理仍不清楚［4］。本文對(duì)內(nèi)源蛋白酶如何影響肉類食品風(fēng)味進(jìn)行了綜述，以期為研究?jī)?nèi)源蛋白酶作用下肉類食品風(fēng)味的形成提供理論依據(jù)。

1 蛋白酶

蛋白水解酶是水解多肽或蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶的統(tǒng)稱，簡(jiǎn)稱蛋白酶［4］。根據(jù)蛋白酶水解多肽的位點(diǎn)不同，可將其分為內(nèi)肽酶和外肽酶。內(nèi)肽酶是水解蛋白質(zhì)和多肽內(nèi)部肽鍵的一類酶;外肽酶是從蛋白質(zhì)分子的氨基或羧基的末端逐個(gè)將肽鍵水解而得到游離氨基酸的一類酶。

1.1 內(nèi)肽酶

1.1.1 組織蛋白酶

組織蛋白酶按照其活性中心氨基酸序列的不同可分為3類，即絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶［5］。目前已從許多動(dòng)物肌肉或者內(nèi)臟中分離純化出多種組織蛋白酶，如已從牛肉中分離純化得到組織蛋白酶B［6］，在兔肉中分離純化得到組織蛋白酶D［7］，在鯉魚肝胰臟中分離純化得到組織蛋白酶S［8］，另外，組織蛋白酶 A 到 Z 均已有報(bào)道［9］，而目前研究較多的組織蛋白酶有組織蛋白酶B、L、D、H。組織蛋白酶在食品風(fēng)味物質(zhì)形成過程中發(fā)揮了重要作用，其與干腌火腿［1］、鹽水鴨［10］和干腌香腸［11］中具有呈味特性的氨基酸與小肽的形成有關(guān)。

1.1.1.1 組織蛋白酶B、L和H

組織蛋白酶和B、L和H都是半胱氨酸蛋白酶，這些蛋白酶是肌肉中重要的內(nèi)肽酶，對(duì)肌肉蛋白質(zhì)的降解起著重要的作用，研究表明組織蛋白酶B能夠水解肌球蛋白、肌鈣蛋白、原肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白，Hughes研究發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶B對(duì)肌動(dòng)蛋白有較強(qiáng)的水解作用，能從蛋白質(zhì)的N端和C端水解得到大量的肽類，而且這些肽類大多數(shù)為水溶性多肽［12］，這可能對(duì)肉類食品的風(fēng)味形成具有重要的作用;組織蛋白酶L對(duì)的肌原纖維蛋白的水解能力最強(qiáng)，包括肌鈣蛋白的T亞基、I亞基和C亞基［13］。

組織蛋白酶B、L和H的活力受多種因素的影響，其肉類食品的加工和貯存過程中都有其最適的溫度和pH［14-15］;除此之外，肉類食品本身還天然存在半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)，其能夠?qū)е陆M織蛋白酶的酶活降低［16］;研究表明，在干腌制品中NaCl的濃度與組織蛋白酶B、L和H的活性呈負(fù)相關(guān)，蛋白酶的活力隨鹽濃度的增加而減?。?7］;肉類食品的水分活度對(duì)組織蛋白酶的活力也有一定的影響，在加工過程中，組織蛋白酶的活力隨著水分活度的降低而下降［18］。

1.1.1.2 組織蛋白酶D

組織蛋白酶D是一種天冬氨酸蛋白酶，研究表明其能夠水解肌球蛋白重鏈、原肌球蛋白以及肌鈣蛋白的T亞基和I亞基［19］，組織蛋白酶D屬于酸性蛋白酶，因?yàn)槠渥钸mpH值在3.0～4.5之間;溫度對(duì)組織蛋白酶D的活力影響較大，在低溫環(huán)境下易失活［20］;組織蛋白酶D的活力較組織蛋白酶B、L和H的活力更不穩(wěn)定，容易在肉類食品的加工和運(yùn)輸過程中失活，但有研究表明，在合適的條件下組織蛋白酶D可以多位點(diǎn)水解肌動(dòng)蛋白而生成7～13個(gè)氨基酸殘基組成的小肽［21］，其在肉類食品風(fēng)味形成中的貢獻(xiàn)目前研究較少，相比與組織蛋白酶B、L和H其貢獻(xiàn)可能要小很多，因?yàn)橐延醒芯孔C明組織蛋白酶D在加工后期較易失活［22］。

1.1.2 鈣激活蛋白酶

鈣激活蛋白酶是一類需Ca2+激活的半胱氨酸內(nèi)肽酶，能夠降解肌鈣蛋白的T亞基和Ⅰ亞基、原肌球蛋白、C-蛋白、細(xì)絲蛋白、結(jié)蛋白、肌聯(lián)蛋白［23-24］，而對(duì)肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、α-輔肌動(dòng)蛋白和肌鈣蛋白C不起作用［1］。鈣激活蛋白酶在中性pH附近(大約為7.5)具有最大活力，pH為6時(shí)活力較低。鈣激活蛋白酶對(duì)肉類食品風(fēng)味物質(zhì)形成的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于組織蛋白酶對(duì)肉類食品風(fēng)味的影響，但其在肌肉死后成熟嫩化中起著重要的作用［25］。

1.2 外肽酶

1.2.1 二肽酶

二肽酶(dipeptidase，DPP)是作用于多肽和蛋白質(zhì)的氨基末端水解產(chǎn)生二肽產(chǎn)物的蛋白酶。由二肽酶作用生成的二肽是肉類食品中重要的風(fēng)味物質(zhì)。根據(jù)底物性質(zhì)、最適pH值、亞細(xì)胞定位、分子質(zhì)量和催化特性，二肽酶可分為 DPPⅠ、DPPⅡ、DPPⅢ和DPPⅣ四種［26］。在火腿風(fēng)味形成過程中二肽酶起著重要作用，由DPP水解多肽產(chǎn)生的二肽類物質(zhì)與游離氨基酸、非揮發(fā)性物質(zhì)共同構(gòu)成火腿的主要風(fēng)味物質(zhì)［27］。

1.2.2 氨肽酶

氨肽酶是一類從蛋白質(zhì)或者肽鏈的氨基端選擇性切割氨基酸殘基的一類外肽酶的總稱，是一種金屬蛋白酶［28］。氨肽酶的種類繁多，根據(jù)其對(duì)各種氨基酸殘基切割特異性分為亮氨酰氨肽酶(LAP)、丙氨酰氨肽酶(AAP)、精氨酰氨肽酶(RAP)、酪氨酰氨肽酶(TAP)和賴氨酰氨肽酶(LysAP)等，其中對(duì)風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)較大的是LAP、RAP和AAP［29］。氨肽酶的活力受多種因素的影響，不同來源的氨肽酶最適溫度不同，最低為35℃，最高為65℃，這可能與物種不同有關(guān)，也可能與物種的棲息環(huán)境有關(guān);不同來源氨肽酶最適pH值在7.0～8.8之間，屬中性至弱堿性范圍，說明氨肽酶是一種中性蛋白酶或堿性蛋白酶［30-33］。

過去的大量研究發(fā)現(xiàn)，在干腌火腿加工過程中，肌肉中的游離氨基酸濃度不斷升高，特別是谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、纈氨酸和賴氨酸，只有谷氨酰胺的含量有所下降，這些游離氨基酸都具有其各自的滋味特征，對(duì)火腿的風(fēng)味形成起著至關(guān)重要的作用，研究者認(rèn)為，這與豬骨骼肌中的氨肽酶活性有關(guān)［27］。氨肽酶主要在蛋白質(zhì)降解的后期起作用，蛋白質(zhì)經(jīng)各種內(nèi)肽酶降解為多肽后，再經(jīng)氨肽酶進(jìn)一步降解為小肽和氨基酸［1］。在干腌火腿加工過程中，氨肽酶水解產(chǎn)生的小肽和游離氨基酸是火腿特征風(fēng)味的重要來源。除此之外，氨肽酶還有從N端切除疏水性氨基酸殘基而脫苦的作用［34］。

2 內(nèi)源蛋白酶對(duì)肉類食品風(fēng)味的影響

風(fēng)味是通過對(duì)攝入口腔的食物的化學(xué)感覺而獲得的印象，其中包括氣味(嗅覺器官的感覺)、滋味(味覺器官的感覺)［35］。蛋白質(zhì)在內(nèi)源酶作用下可分解為各類氨基酸和小肽，其可作為滋味化合物，也可作為氣味前體物質(zhì)［36］。在肌肉中發(fā)生的蛋白質(zhì)水解反應(yīng)主要是由于組織蛋白酶、鈣中性蛋白酶和氨肽酶的作用［37］。

2.1 內(nèi)源蛋白酶對(duì)肉類食品氣味的影響

肉類食品的氣味由各類揮發(fā)性成分提供，主要有烴類、醛類、醇類、酮類、酯類和雜環(huán)類等。不同類揮發(fā)性成分具有不同的特征味［38］，如p-二甲苯呈現(xiàn)水果香味［39］、辛醛和壬醛呈現(xiàn)鮮草的青香氣味［40］。

氣味化合物大多來源于脂肪的氧化分解，部分來源于氨基酸的降解，大量研究已表明氨基酸和多肽是肉香的重要前體物質(zhì)［10］。Spanier等報(bào)道了組織蛋白酶B和L是最有可能在牛肉后熟階段參與肽香味前體生成的內(nèi)源蛋白酶，烹調(diào)后仍能保留較強(qiáng)活性［41］。加熱過程中的美拉德反應(yīng)以及游離氨基酸Strecker降解能產(chǎn)生大量的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，形成肉類食品特殊的芳香氣味［2，42］。

在Serrano火腿特征香味物質(zhì)形成過程中，在組織蛋白酶(特別是組織蛋白酶B與L)與氨肽酶的作用下生成纈氨酸和亮氨酸。纈氨酸和亮氨酸可作為香味前提物質(zhì)，通過Strecker降解生成具有奶酪味和青草味2-甲基丙醛和2-甲基丁醛［36］。在對(duì)南京板鴨風(fēng)味物質(zhì)研究過程中，組織蛋白酶活力與蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物種類與含量不斷發(fā)生變化，鑒定出的90種揮發(fā)性風(fēng)味化合物在含量和比例上不斷改變，其中部分支鏈酸、支鏈醇、支鏈酮、含硫化合物和含氮化合物都與內(nèi)源蛋白酶的作用有關(guān)［4］。

內(nèi)源蛋白酶對(duì)火腿的最終風(fēng)味與品質(zhì)形成起到不可替代的作用。由于揮發(fā)性風(fēng)味化合物的形成受多種因素的影響，其過程極為復(fù)雜，難以直接研究清楚揮發(fā)性化合物與內(nèi)源蛋白酶活力之間的關(guān)系。陸應(yīng)林［4］等嘗試用逐步回歸和層次聚類分析等統(tǒng)計(jì)方法分析肌肉組織蛋白酶與揮發(fā)性風(fēng)味化合物之間的關(guān)系，但發(fā)現(xiàn)3種組織蛋白酶與蛋白降解產(chǎn)物無(wú)法建立回歸方程，與揮發(fā)性風(fēng)味化合物也無(wú)法建立二維空間圖，因此，內(nèi)源蛋白酶與揮發(fā)性化合物之間的關(guān)系和作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

2.2 內(nèi)源蛋白酶對(duì)肉類食品滋味的影響

滋味是肉制品的重要感官特性之一，公認(rèn)的基本味覺有酸、甜、苦、咸和鮮［43］。肉類食品的滋味物質(zhì)主要有游離氨基酸、肽、核苷酸和無(wú)機(jī)鹽。蛋白質(zhì)的降解是氨基酸和肽形成的重要途徑之一，在肉類食品中，內(nèi)源蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解發(fā)揮著重要的作用，蛋白質(zhì)在組織蛋白酶與鈣中性蛋白酶的作用下降解為多肽，多肽在肽酶(主要是氨肽酶)的作用下降解為小肽和氨基酸，不同的肽與氨基酸具有不同的呈味特性，從而使肉呈現(xiàn)不同的滋味。

在肉類食品的加工與貯藏過程中極易感染微生物，微生物可產(chǎn)生蛋白酶進(jìn)而影響食品滋味，但Verplaetse［44］等在研究微生物蛋白酶與肉類本身蛋白酶的對(duì)滋味的影響作用時(shí)，在加工香腸的過程中添加微生物抑制劑(抗生素)和蛋白酶抑制劑(胃蛋白酶抑制劑和亮肽素)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加蛋白酶抑制劑組蛋白的降解率比添加微生物抑制劑組受到更大程度的影響，滋味特性也受到了更大的影響，這表明肉類本身的內(nèi)源性蛋白酶在蛋白降解過程中比微生物分泌的蛋白酶發(fā)揮更大的作用［44］。Molly，K.在香腸風(fēng)味形成過程中也證實(shí)了此結(jié)果［45］。

動(dòng)物肌肉中存在多種內(nèi)肽酶與外肽酶，對(duì)肉類食品的滋味形成有不可替代的作用。在干腌火腿滋味物質(zhì)形成過程中，組織蛋白酶與氨肽酶(特別是丙氨酰氨肽酶)起了重要作用，研究發(fā)現(xiàn)在干腌火腿中氨肽酶活性為新鮮火腿的25% ～75%，Glu、Leu、Arg、Ala、Tyr和Lys的含量明顯增加，干腌過程中游離氨基酸含量的增加是氨肽酶的作用所致［46］。江玉霞等在研究金華火腿蛋白質(zhì)降解規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)非蛋白態(tài)氮的含量持續(xù)上升，在發(fā)酵末期非蛋白態(tài)氮含量是開始階段的2倍，認(rèn)為主要是由于組織蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解作用貫穿火腿加工的整個(gè)過程;由組織蛋白酶B作用使呈甜味的甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸與呈鮮味的天門冬氨酸和谷氨酸含量都上升［47］。張紅梅在研究蛋白酶在發(fā)酵香腸成熟過程中的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)在這過程中降解蛋白質(zhì)的主要是組織蛋白酶與鈣激活蛋白酶，組織蛋白酶中起作用的主要為組織蛋白酶B和組織蛋白酶D，這些酶對(duì)蛋白質(zhì)降解而產(chǎn)生的肽、氨基酸以及小分子的含氮化合物是形成發(fā)酵香腸滋味和質(zhì)量的重要物質(zhì)［11］。Ver-plaetse［48］和 Toldra［49］證實(shí)了發(fā)酵香腸蛋白降解過程主要是內(nèi)源酶的作用，特別是組織蛋白酶B和組織蛋白酶D。陸應(yīng)林在研究南京板鴨滋味物質(zhì)形成過程中，發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B和L的活力與非蛋白氮的含量呈顯著正相關(guān)，組織蛋白酶殘余活力越高，其作用就越強(qiáng)，生成的氨基酸與肽含量越高，從而非蛋白氮積累越多，滋味越顯著［4］。ZHU等人認(rèn)為組織蛋白酶的活性高低與蛋白水解程度的快慢呈正相關(guān)，蛋白質(zhì)的水解程度決定了小肽和氨基酸的生成量，這影響著食品的滋味［50］。由此可見，蛋白質(zhì)的降解反應(yīng)能產(chǎn)生多種滋味物質(zhì)，對(duì)肉類食品的特殊滋味的形成具有關(guān)鍵作用。但過度的蛋白質(zhì)水解會(huì)產(chǎn)生令人不愉快的金屬味與苦味［3］。

另外，氨肽酶還可在食品后熟階段發(fā)揮作用，從N端切除疏水性氨基酸殘基而使多肽脫苦［51］。Virgili，R［52］等在研究豬肉苦味形成的過程中發(fā)現(xiàn)氨肽酶的活性越高，豬肉的苦味就越低，這是由于氨肽酶可以降解苦味肽成非苦味氨基酸，并通過比較苦味重的與苦味輕的豬肉組氨基酸組成，發(fā)現(xiàn)苦味輕的豬肉組酪氨酸與精氨酸的含量較高。

3 小結(jié)與展望

內(nèi)源蛋白酶對(duì)肉類食品的風(fēng)味形成具有重要作用，特別是組織蛋白酶和氨肽酶。目前，在肉類食品中對(duì)風(fēng)味化合物的形成與內(nèi)源蛋白酶之間關(guān)系的研究較少。今后應(yīng)加強(qiáng)對(duì)內(nèi)源蛋白酶與揮發(fā)性化合物和非揮發(fā)性化合物之間的關(guān)系和作用機(jī)理的研究，尋找特定內(nèi)源蛋白酶對(duì)單一風(fēng)味物質(zhì)形成的影響以及其作用機(jī)制。另外，目前的研究大多專注于干腌制品風(fēng)味形成與內(nèi)源蛋白酶活性之間的聯(lián)系，然而在其他肉類食品中的相關(guān)報(bào)道較少，特別是水產(chǎn)類食品中，還尚未見其內(nèi)源蛋白酶與風(fēng)味物質(zhì)之間關(guān)系的研究，日后也可以開拓與加強(qiáng)這一領(lǐng)域的研究以完善肉類食品風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)理。

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